楊清萍

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清中抗環(huán)瓜氨酸肽抗體不同亞型的臨床意義

楊清萍

目的 檢測(cè)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）患者血清中不同亞型的抗環(huán)瓜氨酸肽（CCP）抗體，探討其在RA中的相關(guān)臨床意義。方法 采用ELISA法檢測(cè)135例RA患者、53例非RA的其他結(jié)締組織?。–TD）患者和45例健康體檢者血清中抗CCP抗體-IgA、IgG和IgM，并用比濁法檢測(cè)類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）-IgM。 結(jié)果 RA患者血清中的抗CCP抗體-IgA、IgG、IgM的檢出率分別為57.8%、73.3%、30.4%，均高于CTD組和健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。RA患者的RF-IgM陽(yáng)性者中的抗CCP抗體-IgA、IgG、IgM的陽(yáng)性檢出率均高于RF-IgM陰性者（P＜0.05）。抗CCP抗體-IgA、IgG亞型在≥24個(gè)月、7～23個(gè)月病程組中的陽(yáng)性率高于≤6個(gè)月組（P＜0.05），但≥24個(gè)月與7～23個(gè)月陽(yáng)性率的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。抗CCP抗體-IgM在≥24個(gè)月的陽(yáng)性率低于≤6個(gè)月組（P＜0.05），但7～23個(gè)月與≥24個(gè)月、≤6個(gè)月病程組間的陽(yáng)性率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）?？笴CP抗體-IgA、IgM對(duì)RA的診斷敏感度均低于抗CCP抗體-IgG，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而抗CCP抗體-IgA、IgM的診斷特異度分別與抗CCP抗體-IgG的比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。 結(jié)論 RA患者血清中存在不同亞型的抗CCP抗體，抗CCP抗體-IgA、IgM在RA診斷中與IgG亞型有相似的診斷特異度。

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 抗環(huán)瓜氨酸肽抗體 亞型

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種原因不明的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，對(duì)稱(chēng)性累及外周關(guān)節(jié)的持續(xù)性滑膜炎是其特征性表現(xiàn)，此外常導(dǎo)致多系統(tǒng)的臨床表現(xiàn)?？弓h(huán)瓜氨酸肽（cyclic citrullinated peptide，CCP）抗體作為RA的特異性抗體，已成為新的RA分類(lèi)診斷標(biāo)準(zhǔn)中的血清學(xué)標(biāo)志[1]，且抗CCP抗體在RA的早期診斷[2]、預(yù)后判斷[3]及發(fā)病機(jī)制[4]中起重要的作用。目前，臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)于抗CCP抗體的檢測(cè)通常針對(duì)其IgG亞型，而抗CCP抗體-IgA、IgM亞型在國(guó)內(nèi)卻較少有報(bào)道。因此，筆者通過(guò)檢測(cè)RA患者血清中不同亞型的抗CCP抗體，以探討其在RA中的相關(guān)臨床意義。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2011-05—2012-12本院門(mén)診和住院RA患者135例，男33例，女102例，年齡14～74歲，平均（46±14）歲。其中病程≤6個(gè)月28例，7～23個(gè)月46例，≥24個(gè)月61例。上述所有患者的臨床診斷均符合RA的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[1]。選擇同期在本院門(mén)診和住院的其他結(jié)締組織?。–TD）患者53例，男13例，女40例，年齡14～73歲，平均（47±14）歲。其中系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）27例，干燥綜合征（SS）18例，多發(fā)性肌炎/皮肌炎（PM/ DM）3例，系統(tǒng)性硬化癥（SSc）5例。所有患者的臨床診斷均符合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。選擇同期在本院體檢中心健康體檢者45例，無(wú)感染性疾病、自身免疫性疾病及腫瘤，男12例，女33例，年齡18～72歲，平均（45±15）歲。3組患者一般資料的比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2 方法 所有研究對(duì)象真空采血3ml，經(jīng)離心分離后血清標(biāo)本分裝2份，-80℃凍存?zhèn)溆?，一次凍融后測(cè)定。

1.2.1 抗CCP抗體-IgA、IgG、IgM檢測(cè) 抗CCP抗體-IgG采用德國(guó)歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷股份公司提供的ELISA檢測(cè)試劑盒，在相應(yīng)微孔板中分別加標(biāo)準(zhǔn)品（Cal 1、Cal 2、Cal 3、Cal 4、Cal 5）、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及1∶101稀釋后待檢血清各100μl，室溫下孵育30min。用300μl洗滌緩沖液洗滌3次。相應(yīng)微孔中分別加100μl酶結(jié)合物，室溫下孵育30min。用緩沖液同前洗滌；加100μl/孔底物，室溫避光15min；再加100μl/孔終止液，以450nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，620nm為參考波長(zhǎng)在Sunrise酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）上檢測(cè)吸光度（A）值。以試劑盒中的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以≥5U/ml判斷為陽(yáng)性。所有樣本均檢測(cè)復(fù)孔，每板均設(shè)空白、陰陽(yáng)性對(duì)照?？笴CP抗體-IgA、IgM采用德國(guó)歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷股份公司提供的ELISA檢測(cè)試劑盒（其中酶標(biāo)記二抗從公司另購(gòu)），實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程與抗CCP抗體-IgG相似，以大于健康對(duì)照組A值的+2s 判斷為陽(yáng)性。

1.2.2 類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）-IgM檢測(cè) 采用德國(guó)Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH生產(chǎn)的BNⅡ全自動(dòng)蛋白分析儀及其配套試劑，通過(guò)顆粒增強(qiáng)免疫散射比濁法檢測(cè)血清中的RF-IgM含量，以≥15U/ml判斷為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。RA組與CTD組、健康對(duì)照組血清中抗CCP抗體不同亞型的陽(yáng)性檢出率以及RA患者RF-IgM陰、陽(yáng)性組及不同病程組中的抗CCP抗體亞型的比較均采用四格表χ2檢驗(yàn)?？笴CP抗體-IgA、IgM與IgG在RA組的檢測(cè)敏感度和非RA組（包括CTD組和健康對(duì)照組）中的檢測(cè)特異度采用配對(duì)資料的McNemar χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 3組血清不同亞型抗CCP抗體及RF-IgM陽(yáng)性檢出率的比較 見(jiàn)表1。

表1 3組血清不同亞型抗CCP抗體及RF-IgM陽(yáng)性檢出率的比較[例（%）]

由表1可見(jiàn)，RA組與CTD組、健康對(duì)照組比較，4種抗體的檢出率均明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.2 RA組RF-IgM陽(yáng)性與陰性患者不同亞型抗CCP抗體陽(yáng)性檢出率的比較 見(jiàn)表2。

表2 RA組RF-IgM陽(yáng)性與陰性患者不同亞型抗CCP抗體陽(yáng)性檢出率的比較[例（%）]

由表2可見(jiàn)，RA組RF-IgM陽(yáng)性與RF-IgM陰性的比較，抗CCP抗體-IgA、IgG、IgM陽(yáng)性檢出率的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.3 不同病程的RA患者血清中抗CCP抗體不同亞型的檢出情況 見(jiàn)表3。

表3 不同病程的RA患者血清中抗CCP抗體不同亞型的檢出情況[例（%）]

由表3可見(jiàn)，RA患者血清中抗CCP抗體-IgA、IgG在≥24個(gè)月、7～23個(gè)月病程組中的陽(yáng)性率高于≤6個(gè)月組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），但≥24個(gè)月與7～23個(gè)月陽(yáng)性率的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。抗CCP抗體-IgM在≥24個(gè)月的陽(yáng)性率低于≤6個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但7～23個(gè)月與≥24個(gè)月、≤6個(gè)月陽(yáng)性率的比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.4 抗CCP抗體不同亞型對(duì)RA診斷的評(píng)價(jià)指標(biāo)的比較 見(jiàn)表4。

表4 抗CCP抗體不同亞型對(duì)RA診斷的評(píng)價(jià)指標(biāo)比較[例（%）]

由表4可見(jiàn)，抗CCP抗體-IgA、IgM對(duì)RA的診斷敏感度均低于抗CCP抗體-IgG，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而抗CCP抗體-IgA、IgM的診斷特異度分別與抗CCP抗體-IgG的比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

3 討論

RA是一種抗原驅(qū)動(dòng)，T細(xì)胞介導(dǎo)的常見(jiàn)系統(tǒng)性自身免疫性疾病[5]，其確切的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，可能與多種遺傳因素和環(huán)境因素共同作用所導(dǎo)致。RA患者體內(nèi)存在多種自身抗體，如抗CCP抗體、RF、抗角蛋白抗體（AKA）、抗核周因子（APF）、抗聚角蛋白微絲蛋白抗體（AFA）、抗突變型瓜氨酸波形蛋白（MCV）抗體等[6]，這些抗體對(duì)于RA的診斷和預(yù)后判斷具有重要意義，其中抗CCP抗體為抗瓜氨酸肽/蛋白抗體（anti-citrullinated peptide/protein antibodies，ACPA）中應(yīng)用最為廣泛的一種，自2000年由Schelleken等[7]人工合成環(huán)瓜氨酸肽，并成功采用ELISA檢測(cè)出RA患者血清中的抗CCP抗體。目前對(duì)RA診斷公認(rèn)的特異度和早期診斷的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)在RA診斷中的敏感度為71.7%，特異度為95.2%[8]。上述數(shù)據(jù)也主要基于抗CCP抗體-IgG的檢測(cè)結(jié)果，目前國(guó)內(nèi)外在抗CCP抗體的檢測(cè)試劑中也采用針對(duì)IgG亞型。對(duì)于抗CCP抗體的其他亞型檢測(cè)（如IgA、IgM）在國(guó)內(nèi)卻較少報(bào)道，在國(guó)外也僅有少量研究報(bào)道其在RA中的檢出情況及臨床意義[9-12]。

本研究通過(guò)檢測(cè)135例RA患者血清中的抗CCP抗體-IgA、IgG、IgM，分析其與RF-IgM、病程的相互關(guān)系，及其對(duì)RA診斷指標(biāo)的評(píng)價(jià)，從而探討抗CCP抗體不同亞型在RA中的相關(guān)臨床意義，結(jié)果顯示RA患者血清中的抗CCP抗體-IgA、IgG、IgM的檢出率分別為57.8%、73.3%、30.4%，均高于CTD組和健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明RA患者血清中存在-IgA、IgG、IgM不同的抗CCP抗體，且以抗CCP抗體-IgG為主，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10-12]。其中抗CCP抗體-IgA的檢出率高于上述文獻(xiàn)中的52.9%、43.3%和42.9%，抗CCP抗體-IgG、IgM的檢出率與上述文獻(xiàn)存在一定差異，可能由于遺傳因素和環(huán)境因素的不同從而導(dǎo)致不同人群中抗CCP抗體不同亞型的檢出率差異。對(duì)于抗CCP抗體不同亞型的產(chǎn)生，可能由于RA作為一種自身免疫性疾病，存在T、B淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)異常和固有免疫異常，從而影響針對(duì)瓜氨酸肽/蛋白（抗CCP抗體靶抗原）的不同自身抗體亞型的形成和轉(zhuǎn)換。同一抗體的不同亞型會(huì)形成不同的抗原抗體免疫復(fù)合物，從而可引起如補(bǔ)體激活及吞噬過(guò)程等不同的清除機(jī)制。

此外，在RA診斷傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)RF的比較中，RA患者的RF陽(yáng)性組中的抗CCP抗體-IgA、IgG、IgM的陽(yáng)性檢出率均高于RF陰性組（P＜0.05），說(shuō)明RA患者抗CCP抗體不同亞型的產(chǎn)生與RF存在一定的聯(lián)系，但兩者針對(duì)不同的靶抗原產(chǎn)生的自身抗體，因此，確切的相互關(guān)系有待進(jìn)一步的深入研究。而對(duì)于不同病程的RA患者血清中抗CCP抗體不同亞型的檢出情況，抗CCP抗體-IgA與IgG相似，在≥24個(gè)月、7～23個(gè)月陽(yáng)性率高于≤6個(gè)月組（P＜0.05），但≥24個(gè)月與7～23個(gè)月病程組間的陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?？笴CP抗體-IgM在≥24個(gè)月的陽(yáng)性率低于≤6個(gè)月組（P＜0.05），但7～23個(gè)月與≥24個(gè)月、≤6個(gè)月病程組間陽(yáng)性率的比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究結(jié)果表明：（1）抗CCP抗體-IgA、IgG、IgM可存在于不同病程的RA患者中；（2）抗CCP抗體-IgM在不同病程中的持續(xù)存在，說(shuō)明不斷有針對(duì)抗CCP抗體的B淋巴細(xì)胞持續(xù)免疫反應(yīng)。在抗CCP抗體不同亞型對(duì)RA診斷指標(biāo)的評(píng)價(jià)中，抗CCP抗體-IgA、IgM對(duì)RA的診斷敏感度均低于抗CCP抗體-IgG（P＜0.05），而抗CCP抗體-IgA、IgM的診斷特異度與抗CCP抗體-IgG相似（P＞0.05），表明在IgA、IgG、IgM不同亞型的抗CCP抗體中，IgG亞型對(duì)RA診斷價(jià)值最高。

總之，RA患者血清中存在IgA、IgG、IgM不同亞型的抗CCP抗體，且以抗CCP抗體-IgG為主。對(duì)于不同病程中的抗CCP抗體不同亞型，可反映其特異性的免疫學(xué)反應(yīng)。但不同亞型的抗CCP抗體是否與RA的活動(dòng)性、預(yù)后、療效及發(fā)病機(jī)制相關(guān)，卻有待進(jìn)一步深入研究。

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Clinical significance of the different subtypes of anti-cyclic citrullinated peptide antibodies in patient with rheumatoid arthritis

Objective To investigate the subtypes of the anti-cyclic citrullinated peptide(CCP)antibodies in patients with rheumatoid arthritis(RA)and its clinical significance.Methods The subtypes of anti-CCP antibodies including IgA,IgG and IgM were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)in patients serum samples of 135 patients with RA,53 patients with non-RA connective tissue diseases(CTD)and 45 healthy controls. Results IgA,IgG and IgM anti-CCP antibodies were present in 57.8%、73.3%and 30.4%of RA patients,and their diagnostic specificity was 96.9%,96.9%and 95.9%,respectively. The positive rate of IgA,IgG and IgM anti-CCP antibodies were significant higher than those in non-RA CTD and healthy controls (P＜0.05).The positive rate of IgA,IgG and IgM anti-CCP antibodies were more frequently in RA patients with positive rheumatoid factor(RF)-IgM than that in negative RF-IgM RA patients(P＜0.05).The positive rate of IgA,IgG anti-CCP antibodies in RA patients with disease duration≥24months and 6～24months groups were significant higher than those in≤6 group.The positive rate of IgM anti-CCP antibodies in≥24months group was significant lower than in≤6 group.There was no statistically significant difference(P＞0.05)between 6～24months group and≥24months group or≤6 group. Conclusion The subtypes of anti-CCP antibodies are common in patients with RA.IgA and IgM anti-CCP antibodies are similarly specific for RA as IgG anti-CCP antibodies.

Rheumatoid arthritis Anti-cyclic citrullinated peptide antibodies Subtypes

2013-03-27）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

314000 嘉興市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科

楊清萍，E-mail:yangqp001@sina.com