亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        人乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7、MCF-7/ADM細(xì)胞遷移能力的對比研究

        2013-04-18 08:54:04陳平李克強(qiáng)毛聯(lián)鋼樂東海馮偉云
        浙江醫(yī)學(xué) 2013年23期
        關(guān)鍵詞:拷貝數(shù)小室細(xì)胞株

        陳平 李克強(qiáng) 毛聯(lián)鋼 樂東海 馮偉云

        人乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7、MCF-7/ADM細(xì)胞遷移能力的對比研究

        陳平 李克強(qiáng) 毛聯(lián)鋼 樂東海 馮偉云

        目的 探討乳腺癌細(xì)胞化療繼發(fā)耐藥后細(xì)胞遷移能力的變化,并篩選出相關(guān)基因。 方法 以MCF-7細(xì)胞株為親本細(xì)胞,采用阿霉素(ADM)低濃度持續(xù)加量誘導(dǎo)法建立對ADM耐藥的人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/ADM。應(yīng)用ATP-TCA藥物敏感檢測法和xCELLIigence/RT-CES實(shí)時(shí)細(xì)胞電子分析系統(tǒng)檢測人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MCF-7/ADM對多種化療藥物的耐藥情況。應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)和xCELLIigence/RT-CIM實(shí)時(shí)細(xì)胞電子分析系統(tǒng)檢測人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MCF-7/ADM的細(xì)胞遷移能力。應(yīng)用比較基因組芯片篩選出人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MCF-7/ADM DNA拷貝數(shù)4倍差異的基因。 結(jié)果 撤藥培養(yǎng)150d后,MCF-7/ADM細(xì)胞較親本細(xì)胞MCF-7的ADM耐藥指數(shù)為72.9倍,對其他化療藥物無明顯的交叉耐藥性。MCF-7/ADM細(xì)胞遷移能力較MCF-7明顯降低(P<0.05)。MCF-7/ADM有12種基因DNA拷貝數(shù)是MCF-7的4倍,MCF-7有6種基因DNA拷貝數(shù)是MCF-7/ADM的4倍。 結(jié)論 乳腺癌細(xì)胞化療繼發(fā)耐藥伴隨細(xì)胞遷移能力明顯降低,其相關(guān)基因的DNA拷貝數(shù)亦有明顯差異。

        乳腺癌 阿霉素 化療耐藥 細(xì)胞遷移

        蒽環(huán)類化療藥物作為乳腺癌化療中最常用的藥物,無論在乳腺癌術(shù)前新輔助化療、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移解救治療和早期乳腺癌術(shù)后輔助治療中都占有非常重要的位置。MCF-7是一種體外實(shí)驗(yàn)常用的乳腺癌細(xì)胞株。先前學(xué)者大多單獨(dú)進(jìn)行乳腺癌的耐藥研究,對于腫瘤細(xì)胞繼發(fā)耐藥之后的其他相關(guān)功能研究較少,尤其對于腫瘤細(xì)胞繼發(fā)耐藥之后的轉(zhuǎn)移能力缺乏研究。本研究采用阿霉素(adriamycin,ADM)誘導(dǎo)耐藥,獲得MCF-7/ADM繼發(fā)耐藥細(xì)胞株,觀察耐藥細(xì)胞株和親本細(xì)胞株之間細(xì)胞遷移能力的差異,篩選出相關(guān)基因,為臨床提供幫助。

        1 材料和方法

        1.1 材料 人乳腺細(xì)胞株MCF-7引自中科院上海細(xì)胞庫。RPMI 1640購于Gibco公司。胰蛋白酶、DMSO和小牛血清購于華美生物工程公司。5-氟尿嘧啶(5-FU)購于浙江海正藥業(yè)股份有限公司,ADM購于日本化藥株式會社,多西紫杉醇(TXT)、紫杉醇(PTX)、澤菲(GEM)購于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。Agilent CGH human 244K芯片購于上海芯超公司。Transwell購于美國Corning公司,xCELLIigence/RT-CIM與xCELLIigence/ RT-CES系統(tǒng)購于羅氏公司。

        1.2 方法

        1.2.1 MCF-7/ADM的建立 采用低濃度加量持續(xù)誘導(dǎo)法誘導(dǎo)親本MCF-7細(xì)胞株。以ADM對親本MCF-7IC50(殺傷50%腫瘤細(xì)胞所需藥物濃度)的1/10為起始濃度,逐步提高細(xì)胞培養(yǎng)液中的ADM濃度,待每個(gè)ADM濃度時(shí)細(xì)胞穩(wěn)定生長后再逐步提高藥物濃度,同步監(jiān)測ADM對細(xì)胞的IC50。

        1.2.2 ATP-TCA法檢測細(xì)胞耐藥性 取單細(xì)胞懸液,接種96孔培養(yǎng)板,2×104個(gè)細(xì)胞/孔,加入抗腫瘤藥物(X組),每種藥物參照制藥商的說明書或藥典中的化療藥物血漿峰值濃度(PPC),設(shè)定5個(gè)藥物測試濃度(TDC):200.0%、100.0%、50.0%、25.0%、12.5%PPC。每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)平行孔;另外設(shè)2個(gè)對照組,一個(gè)無藥對照組(M0組),一個(gè)抑制最強(qiáng)組(Mi組)。培養(yǎng)板在37℃,5%CO2培養(yǎng)3~4 d后,用化學(xué)發(fā)光掃描儀測定發(fā)光強(qiáng)度,計(jì)算出平均值。抑制率=[1-(X-Mi)/(M0-Mi)]×100%(注:X、M0、Mi分別為3組的熒光強(qiáng)度抑制率),可用熒光掃描儀自帶軟件計(jì)算出IC50。按下式計(jì)算耐藥指數(shù)(resistance index,RI),RI=耐藥型細(xì)胞(MCF-7/ADM)IC50/野生型細(xì)胞(MCF-7)IC50,將MCF-7/ADM細(xì)胞撤藥后常規(guī)培養(yǎng)并傳代,跟蹤檢測ADM的IC50,求出RI值。

        1.2.3 xCELLIigence/RT-CES系統(tǒng)檢測細(xì)胞增殖能力 在干凈無菌的E-plate中,每孔加入100 μl完全培養(yǎng)液,按要求放入儀器(儀器置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中),讀取培養(yǎng)液的背景數(shù)據(jù)。之后,取出E-plate。在超凈工作臺中接種預(yù)先制備的細(xì)胞懸液,每孔接種8×103個(gè)細(xì)胞,將E-plate再次放入儀器靜置30min。設(shè)置監(jiān)測參數(shù),共監(jiān)測100h,每隔15min監(jiān)測1次,可以觀察到細(xì)胞貼壁及對數(shù)增長的曲線,通過細(xì)胞指數(shù)(cell index,CI)值反應(yīng)細(xì)胞增殖情況。

        1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 取所需數(shù)量小室于一空24孔板中,加100μl無血清培養(yǎng)基到小室內(nèi),培養(yǎng)箱放置1~2h。將處于對數(shù)生長期的各組細(xì)胞用胰酶消化下來,小心移去小室內(nèi)培養(yǎng)基,加600μl含30%FBS(血清濃度可以根據(jù)需要調(diào)整)培養(yǎng)基到下室中。用無血清培養(yǎng)基按一定比例稀釋細(xì)胞,加該細(xì)胞懸液(含1×105~2×105個(gè)細(xì)胞)100μl到每個(gè)小室中,將小室轉(zhuǎn)移入含30%FBS培養(yǎng)基的下室中,培養(yǎng)箱放置4~24h。倒扣小室于吸水紙上去除培養(yǎng)基,用棉拭子輕輕移去非轉(zhuǎn)移細(xì)胞,加400μl染色液到24孔板的空孔中,將小室浸泡染色液中20min,在膜的下表面染色轉(zhuǎn)移細(xì)胞,蒸餾水中浸泡小室,沖洗數(shù)次,晾干后顯微鏡下觀察。用10%醋酸脫色,測定洗脫液OD570值,間接反映發(fā)生細(xì)胞遷移的細(xì)胞數(shù)。

        1.2.5 xCELLIigence/RT-CIM系統(tǒng)檢測細(xì)胞遷移能力 將MCF-7和MCF-7/ADM細(xì)胞分別放于不含血清培養(yǎng)基中生長,并生長4~24h。將培養(yǎng)基加入至底層小室,將頂層小室置于底層小室上面,并將兩者扣合在一起,以進(jìn)行CIM-Plate 16的裝配。在獲得背景測定前,將不含血清培養(yǎng)基放置于頂層小室中進(jìn)行水合處理,并將過濾膜放置于CO2孵育箱中,37℃,1h,進(jìn)行預(yù)孵育處理。于不含血清培養(yǎng)基中對細(xì)胞進(jìn)行輕柔的胰酶消化處理,使細(xì)胞成團(tuán)狀,然后再重新懸浮細(xì)胞。對CIM-Plate 16進(jìn)行平衡處理后,將CIM-Plate 16放置于RTCA DP儀器工作站中,并進(jìn)行背景細(xì)胞指數(shù)值測定。然后從RTCA DP儀器站中移除CIM-Plate 16,并將細(xì)胞加入至頂層中,細(xì)胞密度為理想密度。將CIM-Plate 16放置于RTCA DP儀器站中,并在幾小時(shí)內(nèi),每隔2 min對細(xì)胞遷移情況進(jìn)行監(jiān)測,細(xì)胞信號的強(qiáng)弱代表發(fā)生細(xì)胞遷移的細(xì)胞數(shù)量。按上述方法分別檢測MCF-7在0、25%、50%、100%、200%PPC,MCF-7/ADM在0、500%、1 000%、2 000%、4 000%PPC時(shí)細(xì)胞遷移能力。

        1.2.6 細(xì)胞DNA拷貝數(shù)變化檢測 實(shí)驗(yàn)標(biāo)記方法采用Agilent標(biāo)記方法,各取1.5μg探針進(jìn)行標(biāo)記雜交,雜交方法采用65℃,40h滾動(dòng)雜交,并在室溫洗片。芯片結(jié)果采用Agilent掃描儀進(jìn)行掃描,F(xiàn)eature Extraction軟件讀取數(shù)據(jù)Scanresolution 5μm,PMT 100%,最后采用Feature Extration進(jìn)行Normalize處理分析。CGH Analytics軟件分析數(shù)據(jù),以Z-scoring算法分析,取Window值為1M,Threshold值為4,篩選出乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MCF-7/ADM DNA拷貝數(shù)4倍差異的基因。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以表示,兩樣本間比較采用t檢驗(yàn)。

        2 結(jié)果

        2.1 MCF-7與MCF-7/ADM細(xì)胞耐藥性比較 詳見表1。

        由表1可見,MCF-7/ADM細(xì)胞較之親本細(xì)胞MCF-7,對ADM的IC50明顯升高(P<0.01),RI達(dá)72.9倍,但對其他化療藥物無明顯交叉耐藥性,IC50的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

        表1 MCF-7與MCF-7/ADM細(xì)胞耐藥性比較

        2.2 xCELLIigence/RT-CES系統(tǒng)檢測MCF-7/ADM與MCF-7細(xì)胞體外增殖情況 MCF-7在ADM 50%PPC作用下增殖能力明顯下降,而MCF-7/ADM在ADM 1 000% PPC作用下增殖能力未受到影響,詳見圖1、2。

        2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測MCF-7/ADM與MCF-7細(xì)胞遷移能力 細(xì)胞接種于上室培養(yǎng)24h染色后于顯微鏡下觀察,MCF-7/ADM與MCF-7細(xì)胞組均有細(xì)胞穿過小室濾膜,但MCF-7/ADM細(xì)胞組(圖3)較之MCF-7細(xì)胞組(圖4)穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少,兩組間OD570的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見圖5。

        圖1 MCF-7細(xì)胞在ADM作用下的增殖情況

        圖2 MCF-7/ADM細(xì)胞在ADM作用下的增殖情況

        2.4 xCELLIigence/RT-CIM系統(tǒng)檢測MCF-7/ADM與MCF-7細(xì)胞遷移能力 結(jié)果表明MCF-7/ADM較之親本MCF-7細(xì)胞遷移能力明顯下降。MCF-7細(xì)胞組從22h開始細(xì)胞信號達(dá)到平臺期,表示MCF-7細(xì)胞組22h細(xì)胞遷移即全部完成;而MCF-7/ADM細(xì)胞組經(jīng)過60h,細(xì)胞信號仍未達(dá)到平臺期,表示MCF-7/ADM細(xì)胞組60h尚有部分細(xì)胞未完成遷移,詳見圖6。

        圖3 MCF-7/ADM細(xì)胞Transwell檢測(×100)

        圖4 MCF-7細(xì)胞Transwell檢測(×100)

        圖5 MCF-7/ADM細(xì)胞與MCF-7細(xì)胞的OD570比較

        圖6 MCF-7/ADM與MCF-7細(xì)胞遷移動(dòng)態(tài)圖

        2.5MCF-7/ADM與MCF-7細(xì)胞DNA拷貝數(shù)變化 MCF-7/ADM有12種基因DNA拷貝數(shù)是MCF-7的4倍:TEDDM1,CARF,OR2D2,GINS2,LZTR1,THAP7,CEBPA,F(xiàn)LJ90680,TST,MPST,LGALS1,DDX53;MCF-7有6種基因DNA拷貝數(shù)是MCF-7/ADM的4倍:KFZp686I15217,KAAG1,ISG20,C15orf42,CIRBP,XBP1。

        3 討論

        乳腺癌是我國最常見的惡性腫瘤,化療耐藥和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)是乳腺癌難以根治的主要原因。先前學(xué)者在乳腺癌化療耐藥和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)方面做了大量的工作,但對化療耐藥和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)關(guān)聯(lián)性研究的較少。

        化療耐藥分為原發(fā)性耐藥和繼發(fā)性耐藥。有學(xué)者認(rèn)為[1],腫瘤細(xì)胞中有一細(xì)胞亞群對化療具有先天性耐藥的能力,將此類腫瘤細(xì)胞先天具有對化療的耐受現(xiàn)象稱之為原發(fā)性耐藥。還有一類腫瘤細(xì)胞在高濃度的化療藥物的作用下死亡,而當(dāng)較低濃度的化療藥物反復(fù)作用下其獲得性的對該種藥物產(chǎn)生耐受,其所獲得的耐藥性能在更高濃度的同種或另種化療藥物作用下獲得存活,將此類腫瘤細(xì)胞后天獲得對化療的耐受現(xiàn)象稱之為繼發(fā)性耐藥。ADM是恩環(huán)類抗癌藥物中的經(jīng)典藥物,能與乳腺癌細(xì)胞DNA交叉、聯(lián)結(jié)、抑制DNA復(fù)制,并阻斷RNA聚合酶的作用,抑制RNA的合成。張濤等[2]應(yīng)用三磷酸腺生物熒光體外藥物敏感檢測法(ATP-TCA)發(fā)現(xiàn)乳腺癌對ADM的原發(fā)耐藥率為33%。李艷芬等[3]應(yīng)用ATP-TCA法檢測發(fā)現(xiàn)乳腺癌對表ADM的原發(fā)耐藥率為37.3%。由此可見,乳腺癌對ADM和表阿霉素的耐藥主要為繼發(fā)性耐藥。

        有學(xué)者在乳腺癌細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中觀察到ADM繼發(fā)性耐藥細(xì)胞MCF-7/ADM較之親本乳腺癌細(xì)胞MCF-7遷移能力明顯降低[8]。在本研究中,通過低濃度加量持續(xù)誘導(dǎo)法誘導(dǎo)MCF-7/ADM耐藥細(xì)胞株,同時(shí)通過ATP-TCA檢測法和xCELLIigence/RT-CES實(shí)時(shí)細(xì)胞電子分析系統(tǒng)檢測人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MCF-7/ ADM對多種化療藥物的耐藥情況,結(jié)果顯示MCF-7/ ADM較之MCF-7細(xì)胞對ADM明顯耐藥。同時(shí)應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)和xCELLIigence/RT-CIM實(shí)時(shí)細(xì)胞電子分析系統(tǒng)檢測人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MCF-7/ADM的細(xì)胞遷移能力,結(jié)果顯示MCF-7/ADM較之MCF-7細(xì)胞遷移能力明顯降低。

        有研究表明,化療耐藥細(xì)胞其發(fā)生轉(zhuǎn)移的情況較多,也就是說化療耐藥細(xì)胞往往轉(zhuǎn)移能力也較強(qiáng)[8]。而本研究中MCF-7/ADM較之MCF-7細(xì)胞遷移能力明顯降低,這與我們傳統(tǒng)的認(rèn)識具有一定的差距。

        轉(zhuǎn)移是一個(gè)極其復(fù)雜的生物學(xué)過程,我們通常都將腫瘤轉(zhuǎn)移過程簡單地分為以下幾個(gè)步驟,即局部浸潤、滲入血管、隨血液循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移并在其中存活、移出血管、在新的部位定居并增殖。當(dāng)受到外界信號刺激,細(xì)胞間黏附能力降低,癌細(xì)胞獲得遷移表型,從原發(fā)部位脫離,同時(shí)在細(xì)胞外基質(zhì)蛋白酶的作用下降解基底膜,進(jìn)入血管或淋巴管中游走,抵達(dá)特定靶器官形成遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移灶。癌細(xì)胞的遷移雖然是癌轉(zhuǎn)移的重要步驟,但整個(gè)轉(zhuǎn)移的過程中步驟和影響因素很多,雖然細(xì)胞遷移能力下降,但是由于腫瘤細(xì)胞增殖和耐藥能力的提高,最終腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力卻提高了。

        先前關(guān)于轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的研究較多,其中有Rho GTPases、WAVE、LIMK1[4-6]。國內(nèi)外研究已經(jīng)證實(shí)PI3K/ AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在乳腺癌的細(xì)胞遷移和化療藥物紫杉醇、ADM及2,2一二氟脫氧胞嘧啶核苷的耐藥中扮演重要的角色[7-8]。

        本研究中,采用比較基因組芯片技術(shù),檢測了MCF-7/ADM和MCF-7細(xì)胞基因組DNA拷貝數(shù)的差異,MCF-7/ADM基因組是MCF-7基因的4倍有12種:TEDDM1,CARF,OR2D2,GINS2,LZTR1,THAP7,CEBPA,F(xiàn)LJ-90680,TST,MPST,LGALS1,DDX53;MCF-7/ADM基因組是 MCF-7的 4倍有 6種:KFZp686I15217,KAAG1,ISG20,C15orf42,CIRBP,XBP1。

        [1] 徐兵河.腫瘤化療藥物耐藥的概念與現(xiàn)狀[J].中國醫(yī)刊,2005,40(11): 652-656.

        [2]張濤,張保寧,張偉,等.ATP生物熒光腫瘤體外藥物敏感性檢測在乳腺癌中的應(yīng)用[J].腫瘤防治研究,2004,31(12):765-767.

        [3]李艷芬,田海梅,陳國際,等.人乳腺癌細(xì)胞原代培養(yǎng)體外藥敏試驗(yàn)研究[J].臨床腫瘤學(xué)雜志,2006,11(10):768-771.

        [4]王妍,張蓮芬,馮磊,等.人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/W和MCF-7/ADM細(xì)胞中阿霉素結(jié)合蛋白的分析[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2007,23(9):1188-1193.

        [5]Chan A Y,Coniglio S J,Chuang Y Y,et al.Roles of the Rac1 and Rac3 GTPases in human tumor cell invasion[J].Oncogene,2005, 24(53):7821-7829.

        [6]Sossey-Alaoui K,Safina A,Li X,et al.Down-regulation of WAVE3, a metastasis promoter gene,inhibits invasion and metastasis of breast cancer cells[J].Am J Pathol,2007,170(6):2112-2121.

        [7]Wang W,Mouneimne G,Sidani M,et al.The activity status of cofilin is directly related to invasion,intravasation,and metastasis of mammary tumors[J].J Cell Biol,2006,173(3):395-404.

        [8]Zhang G,He B,Weber G F,et al.Growth factor signaling induces metastasis genes in transformed cells:molecular connection between Akt kinase and osteopontin in breast cancer[J].Mol Cell Biol,2003,23(18):6507-6519.

        [9]Liang K,Lu Y,Li X,et al.Differential roles of phosphoinositide-depaendent protein kinase-1 and aktl expression and phosphorylation in breast cancer cell resistance to paclitaxel, doxorubicin,andgemcitabine[J].MolPharmacol,2006,70(3):1045-1052.

        Comparative analysis of cell migration of human breast cancer cell line MCF-7 and MCF-7/ADM

        Objective To investigate the change of the cell migration ability of breast cancer cells with acquired resistance to chemotherapy,and screen the related genes.Methods MCF-7 cells were used as the parental cells,and human breast cancer cell line MCF-7/ADM were established with continuous low concentration of ADM.The chemotherapy resistance of MCF-7 and MCF-7/ADM cell was detected by ATP-TCA drug sensitive test and xCELLIigence/RT-CES real-time cell electronic analysis system.The cell migration of MCF-7 and MCF-7/ADM cell was detected by Transwell test and xCELLIigence/RT-CIM real-time cell electronic analysis system.4 times the difference of DNA copies of Genes in MCF-7 and MCF-7/ADM cell were screeninged by comparative genomic chip. Results The drug resistant index of MCF-7/ADM cell kept on 72.9 times over MCF-7 cell after cultured in the medium(without ADM)for 150 days.MCF-7/ADM had no obvious cross-resistance to other chemotherapy drugs. The cell migration of MCF-7/ADM reduced significantly than that of MCF-7(P<0.05).The DNA copies of 12 genes of MCF-7/ADM cell are 4 times more than that of MCF-7,while the DNA copies of 6 genes of MCF-7 cell are 4 times more than that of MCF-7/ADM. Conclusion The migration ability of breast cancer cells was significantly reduced with acquired chemotherapy resistance,and the DNA copies of some genes are also obvious different.

        Breast cancerADM Chemotherapy resistance Cell migration

        2013-07-08)

        (本文編輯:嚴(yán)瑋雯)

        寧波市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2009A610179)

        315000 寧波市第二醫(yī)院普外科

        李克強(qiáng),E-mail:chasejxmc@163.com

        猜你喜歡
        拷貝數(shù)小室細(xì)胞株
        線粒體DNA拷貝數(shù)變異機(jī)制及疾病預(yù)測價(jià)值分析
        胎兒染色體組拷貝數(shù)變異與產(chǎn)前超聲異常的相關(guān)性分析
        日媒勸“灰小子”早日放開公主
        日本公主的準(zhǔn)婆家靠譜嗎?
        暢談(2018年6期)2018-08-28 02:23:38
        新型寬帶橫電磁波小室的設(shè)計(jì)
        穩(wěn)定敲低MYH10基因細(xì)胞株的建立
        Rab27A和Rab27B在4種不同人肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)
        穩(wěn)定抑制PAK2蛋白表達(dá)的HUH—7細(xì)胞株的建立
        DNA序列拷貝數(shù)變化決定黃瓜性別
        線粒體DNA拷貝數(shù)的研究新進(jìn)展
        色费女人18毛片a级毛片视频| 亚洲 国产 哟| 午夜无码片在线观看影院y| 日本一级淫片免费啪啪| 高清成人在线视频播放| 国产在线一区二区三区四区乱码 | 国产精品成人免费视频一区| 亚洲av片一区二区三区| 国产在线手机视频| 亚洲素人日韩av中文字幕| 白浆国产精品一区二区| 国产做无码视频在线观看| 久久午夜无码鲁丝片直播午夜精品| 久青草国产视频| 精品一区二区三区四区少妇| 在线高清亚洲精品二区| 偷拍一区二区盗摄视频| 97精品国产97久久久久久免费| 久久久久99精品成人片试看| 欧美性久久| 日本人妻系列一区二区| 日本在线观看一区二区三| 日本最新免费二区三区| 国产精品高潮呻吟av久久无吗| 2021国产精品一区二区在线| 久久人妻av不卡中文字幕| 在线女同免费观看网站| 老熟女老女人国产老太| 亚洲精品第一国产综合精品 | 国产av精品一区二区三| 国产zzjjzzjj视频全免费| 欧美人与物videos另类| 亚洲精品在线免费视频| 国产又猛又黄又爽| 无码人妻精一区二区三区| 日韩区在线| 一区二区亚洲精美视频| 男女肉粗暴进来动态图| 2019年92午夜视频福利| 偷拍激情视频一区二区| 久久精品熟女亚洲av香蕉|