安艷輝 商建偉 閆博 王旭昀 李鐵 張耀圣

精索靜脈曲張(varicocele, VC)是常見的男性泌尿生殖系統(tǒng)疾病，也是導(dǎo)致男性不育常見的原因之一，在男性不育癥中占19%～41%[1]。世界衛(wèi)生組織將VC列為男性不育的首位原因。目前對補(bǔ)中益氣湯的藥理研究證實(shí)，補(bǔ)中益氣湯具有抗不育的藥理作用。前期課題組運(yùn)用補(bǔ)中益氣湯治療精索靜脈曲張不育患者，療效顯著。一氧化氮(nitric oxide,NO)是內(nèi)皮源性血管舒張因子的主要活性成分，是一種具有廣泛生物活性的信使分子和毒性分子,參與多種生理和病理活動(dòng),其在VC不育的發(fā)病機(jī)制中占有重要地位。本研究通過觀察比較各組大鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)和腹主動(dòng)脈血中NO含量變化,探討補(bǔ)中益氣湯對VC大鼠睪丸生精功能和腹主動(dòng)脈血中NO濃度的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及場所

SD成年雄性大鼠 30只，清潔級，體重210～240 g,購自北京金牧陽實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司,動(dòng)物合格證號：SCXK(京)2009-0017。實(shí)驗(yàn)場所為東直門醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境溫度19～23℃，相對濕度為20%～30%。

1.2 分組、動(dòng)物模型的建立

動(dòng)物購進(jìn)后按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組和治療組，所有組別普通飼養(yǎng)(飼料由實(shí)驗(yàn)室供應(yīng))，定時(shí)喂養(yǎng)，自由飲水。動(dòng)物購進(jìn)分組后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,觀察無異常后開始造模。

模型的制備方法參照Saypol和Turner等人的方法[2]：用3.5%的水合氯醛按1 ml/100 g體重腹腔注射給藥，麻醉成功后將大鼠固定于鼠板上，腹部備皮。在無菌操作下沿腹中線切1縱行開口，逐層分離，打開腹腔后先用浸有生理鹽水的濕棉球?qū)⒆髠?cè)結(jié)腸等腹腔內(nèi)容物推向右側(cè)，充分暴露左腎靜脈、左腎上腺靜脈、左側(cè)精索靜脈，從左腎上腺靜脈入左腎靜脈口處剝離左腎靜脈段，在左腎靜脈下放1根3/0絲線備用，把1個(gè)5 ml注射器針頭平行放置于剝離的左腎靜脈上，用帶測微器的目鏡測量左精索靜脈直徑，然后將針頭和左腎靜脈一起接扎，緩慢拔出針頭，左腎靜脈直徑縮小至接扎前的1/2，造成左腎靜脈的部分狹窄，最后尋找左精索內(nèi)靜脈與左髂總靜脈之間的交通支，分離后用絲線接扎，還納腹腔內(nèi)容物，逐層縫合皮膚。模型組和治療組按照上述方法造模，正常組僅打開腹腔，剝離暴露各靜脈，不進(jìn)行左腎靜脈接扎。

1.3 藥物治療和動(dòng)物模型成功的判定方法

動(dòng)物造模1周后開始藥物干預(yù)。治療組用補(bǔ)中益氣湯顆粒劑灌胃，補(bǔ)中益氣湯顆粒劑藥物組成：生黃芪30 g、人參9 g、白術(shù)10 g、柴胡6 g、升麻6 g、當(dāng)歸15 g、陳皮15 g、炙甘草9 g，在東直門醫(yī)院免煎顆粒藥房按照以上劑量制備成顆粒劑，用藥前用雙蒸水將藥物稀釋成濃度為1.4 g/ml的藥液，按1 ml/100 g體重灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃45天(大鼠的平均生精周期為12.6天)。正常組和模型組均按1 ml/100 g體重灌胃雙蒸水每日1次，連續(xù)灌胃45天，不進(jìn)行其他干預(yù)。各組均給與普食飼養(yǎng)，自由飲水。

模型組和藥物治療組分別于藥物治療45天后，用3.5%水合氯醛按1 ml/100 g進(jìn)行腹腔注射，待麻醉成功后，打開腹腔，用帶測微器的目鏡測量大鼠左精索內(nèi)靜脈直徑,觀察其曲張程度, 若左側(cè)精索內(nèi)靜脈擴(kuò)張，雙側(cè)腎臟都未出現(xiàn)萎縮，并且雙側(cè)腎臟質(zhì)量無明顯差異,判定手術(shù)造模成功。

1.4 NO檢測、睪丸病理切片及Johnson’s評分方法

各組大鼠藥物治療45天后，麻醉?xiàng)l件下打開腹腔，抽取腹主動(dòng)脈血2 ml后, 將血樣迅速低溫離心，分離血清，把分離后血清放置60℃冰箱冷存，交由北京康源瑞德生物有限公司采用硝酸還原酶法檢測NO，按試劑盒操作進(jìn)行。取雙側(cè)睪丸組織固定于Bouin’s溶液中24小時(shí),在置于70%乙醇24小時(shí)，隨后以石蠟包埋。5 μm厚切片，脫蠟，以蘇木精-伊紅(HE)染色。睪丸病理切片由東直門醫(yī)院病理科制備，觀察各組睪丸生精上皮變化，并作Johnson’s評分[3]，評分共分10個(gè)等級，積分越高，精子發(fā)生越好，積分越低，精子發(fā)生障礙越嚴(yán)重。

評分標(biāo)準(zhǔn)：10分：完好的精子發(fā)生和許多精子，生精細(xì)胞層次規(guī)則；9分：有很多精子，但生精細(xì)胞排列紊亂，管腔內(nèi)有脫落的生精細(xì)胞；8分：切片中僅發(fā)現(xiàn)少數(shù)精子；7分：無精子但有許多精子細(xì)胞；6分：無精子，僅少許精子細(xì)胞；5分：無精子及精子細(xì)胞，但有許多精母細(xì)胞；4分：極少數(shù)精母細(xì)胞，無精子及精子細(xì)胞；3分：僅有精原細(xì)胞；2分：僅有支持細(xì)胞；1分：完全透明變形。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠腹主動(dòng)脈血中NO含量

正常組中腹主動(dòng)脈血中NO含量為(10.2174±3.6164)μmol/L，模型組中腹主動(dòng)脈血中NO含量為(17.8035±2.8055)μmol/L，治療組中腹主動(dòng)脈血中NO含量為(16.3285±3.6164)μmol/L。正常組與模型組血清NO含量采用采用配對t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組與治療組血清NO含量采用采用配對t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腹主動(dòng)脈血中NO含量

2.2 睪丸病理切片結(jié)果

正常組中：大鼠睪丸曲細(xì)精管排列規(guī)則、緊密有序；曲細(xì)精管由基膜、肌樣細(xì)胞與膠原纖維交替層所組成的界膜包繞；曲細(xì)精管內(nèi)含有各級生精細(xì)胞及支持細(xì)胞(Sertoli細(xì)胞)?；字凉芮?，依次有精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞及大量精子，亦見支持細(xì)胞，其基部緊貼基膜，頂部伸達(dá)管腔；曲細(xì)精管間的間質(zhì)為疏松結(jié)締組織，未見著變(見圖1、圖2)。模型組中：大鼠睪丸局灶性或片狀曲細(xì)精管萎縮；各級生精細(xì)胞排列疏松紊亂，管內(nèi)生精細(xì)胞數(shù)量明顯減少，生精細(xì)胞脫落于管腔中，精子發(fā)生停滯；少數(shù)病變嚴(yán)重者，曲細(xì)精管內(nèi)僅有支持細(xì)胞，管腔伴鈣化；間質(zhì)有水腫，病變嚴(yán)重者，間質(zhì)細(xì)胞增生(見圖3、圖4)。治療組中：大鼠睪丸組織散在個(gè)別曲細(xì)精管內(nèi)生精細(xì)胞減少，不見僅有支持細(xì)胞的曲細(xì)精管，病變范圍及程度分別較圖3和圖4明顯減輕(見圖5、圖6)。

圖1 灌胃45天后，正常組大鼠左側(cè)睪丸組織(HE染色，×400)

圖2 灌胃45天后，正常組大鼠右側(cè)睪丸組織(HE染色，×400)

圖3 灌胃45天后，模型組大鼠右側(cè)睪丸組織(HE染色，×400)

圖4 灌胃45天后，模型組大鼠左側(cè)睪丸組織(HE染色，×400)

圖5 灌胃45天后，治療組大鼠左側(cè)睪丸組織(HE染色，×400)

圖6 灌胃45天后，治療組大鼠右側(cè)睪丸組織(HE染色，×400)

2.3 Johnson’s評分結(jié)果

模型組大鼠睪丸組織的Johnson評分結(jié)果為(6.81±1.15)，與正常組評分結(jié)果(10.19±0.31)相比，明顯降低，進(jìn)行配對t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，治療組Johnson評分為(8.73±0.28)，明顯升高，進(jìn)行配對t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

補(bǔ)中益氣湯原載于金代名醫(yī)李東垣《脾胃論》，由黃芪、人參、白術(shù)、陳皮、升麻、柴胡、當(dāng)歸、炙甘草組成，具有調(diào)補(bǔ)脾胃、補(bǔ)中益氣、升陽舉陷之功。補(bǔ)中益氣湯含有多種人體所需物質(zhì)，如黃芪多糖，果糖，氨基酸，維生素B及鋅，尤其是果糖及鋅對精子活動(dòng)極其重要。Amano等[4]證實(shí)，補(bǔ)中益氣湯在體外可以有效提高精子的運(yùn)動(dòng)能力，但不影響精子的熒光參數(shù)。Furuya等[5]基于傳統(tǒng)辨證將補(bǔ)中益氣湯用于自發(fā)性男性不育，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)中益氣湯可以有效提升精子數(shù)量和運(yùn)動(dòng)能力，升高精液可溶性Fas 水平，并指出中藥應(yīng)用需要辨證論治。課題組前期應(yīng)用補(bǔ)中益氣湯治療VC不育患者，療效顯著。

Turner等[6]研究發(fā)現(xiàn)，人類和大鼠左腎靜脈受壓后，其脈管反應(yīng)是出現(xiàn)左側(cè)精索內(nèi)靜脈曲張，并重新建立相似的側(cè)支循環(huán)，血液都回流到髂靜脈末端。人類和大鼠左側(cè)精索靜脈回流受阻后反應(yīng)的相似性，為課題組用大鼠模型研究VC的病理生理提供了理論上的可行性。在本實(shí)驗(yàn)研究中模型組大鼠與正常組大鼠相比，睪丸的生精細(xì)胞結(jié)構(gòu)層次紊亂、精子數(shù)量減少，Johnson’s評分結(jié)果也表明模型組大鼠睪丸生精功能出現(xiàn)明顯損害，這與文獻(xiàn)報(bào)道的情況相似，這表明VC損害了大鼠睪丸的生精功能。治療組與模型組相比，大鼠睪丸生精功能損害減輕，Johnson’s評分結(jié)果也表明治療組大鼠睪丸生精功損害程度較模型組輕，這說明補(bǔ)中益氣湯能夠減輕VC對大鼠睪丸生精功能的損害。

NO是一種具有廣泛生物學(xué)活性的信使分子和毒性分子[7]。有體外實(shí)驗(yàn)表明：NO對精子功能的影響具有雙重性，高濃度的NO損害睪丸的生精功能，而低濃度的NO則能提高精子的活動(dòng)度。不難發(fā)現(xiàn)NO在精索靜脈曲張不育研究中占有重要地位。劉蕾等[8]通過研究VC大鼠睪丸組織中TNF-α和NO含量的變化，認(rèn)為VC時(shí)TNF升高使得精子細(xì)胞生成、維持、成熟受到損傷，降低生育能力；VC時(shí)過量產(chǎn)生的NO損傷睪丸組織細(xì)胞，進(jìn)而影響生精及精子成熟過程；TNF-α和NO之間相互作用，誘發(fā)睪丸組織免疫反應(yīng)，同樣會(huì)損傷睪丸組織。孫自學(xué)等[9]通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：精索靜脈曲張模型組睪丸組織內(nèi)NO合成酶活性增強(qiáng)，NO合成增加，過量的NO抑制了精子ATP的合成，損害精子功能。本研究中模型組和治療組中NO含量顯著高于正常組(P<0.01)，模型組NO含量明顯高于正常組，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相一致；但是模型組和治療組中NO含量差異無顯著性(P>0.05)，這與部分文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果不同，課題組認(rèn)為出現(xiàn)這種情況的原因有：(1)研究部位不同所引起,以往研究中多檢測人精索靜脈血液或者大鼠睪丸組織中NO含量，而本研究檢測的是大鼠腹主動(dòng)脈血液中NO含量；(2)觀察周期不同所引起，本研觀察周期為45天，與部分文獻(xiàn)報(bào)道相比周期較短；(3)VC大鼠腹主動(dòng)脈血中NO含量與其睪丸生精功能無相關(guān)性。

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