潘紅松 湯崇輝 傅小君 許信龍 魏曉捷 方戰(zhàn)艦

顱腦損傷后腦組織中水通道蛋白4表達(dá)的變化

潘紅松 湯崇輝 傅小君 許信龍 魏曉捷 方戰(zhàn)艦

目的 研究顱腦損傷后水通道蛋白4（AQP-4）在腦組織中表達(dá)的變化及其臨床意義。 方法 對(duì)27例顱腦損傷患者行開顱手術(shù)，將術(shù)中取得的挫傷水腫腦組織（損傷組）和顳極減壓獲得的相對(duì)正常腦組織（對(duì)照組）進(jìn)行AQP-4的免疫組化和real-time PCR檢測(cè)。結(jié)果 損傷組各時(shí)點(diǎn)挫傷水腫腦組織AQP-4的表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組（均P＜0.05）；損傷24h后周圍水腫腦組織中的AQP-4表達(dá)量顯著升高。 結(jié)論 顱腦損傷后腦水腫的形成和發(fā)展與AQP-4的異常表達(dá)密切相關(guān)。

顱腦損傷 腦水腫 水通道蛋白4

腦水腫是顱腦創(chuàng)傷后最常見(jiàn)也是最嚴(yán)重的繼發(fā)性損傷，盡管以往有許多此類研究，但人們對(duì)其發(fā)生機(jī)制尚不清楚[1]。關(guān)于水通道蛋白4（aquaporin-4，AQP-4）在外傷性腦水腫中的作用，以往亦有許多研究，但結(jié)論并不一致，且大部分研究是以動(dòng)物為研究對(duì)象，對(duì)人體的研究很少。本研究以急性顱腦損傷患者手術(shù)標(biāo)本為研究對(duì)象，檢測(cè)并比較挫傷灶周圍水腫腦組織和顳極減壓獲得的正常腦組織中AQP-4的表達(dá)量，分析AQP-4與急性顱腦損傷后腦水腫的關(guān)系，探索其在腦水腫形成過(guò)程中的作用和規(guī)律，為臨床治療腦水腫提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選擇慈溪市人民醫(yī)院2010-01—2010-12因急性顱腦損傷住院手術(shù)治療的27例患者，其中男17例，女10例；年齡17～65歲，平均（38.6±11.5）歲；致傷原因?yàn)檐嚨渹?0例，跌墜傷5例，打擊傷2例；術(shù)前GCS評(píng)分3～8分14例，9～12分9例，13～15分4例；受傷至手術(shù)時(shí)間＜6h9例，6～24h10例，＞24h8例。將開顱手術(shù)時(shí)切除的挫傷水腫的腦組織作為損傷組，顳極減壓時(shí)切除的相對(duì)正常的腦組織作為對(duì)照組。本研究方案得到醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，治療措施均得到患者家屬的知情同意。

1.2 檢測(cè)儀器及材料 AQP-4一抗、兔三步法二抗均為美國(guó)SANTA CRUZ公司產(chǎn)品,由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA）、定量試劑盒（TAKARA）由寶生物工程有限公司提供；定量PCR儀器ABI7500為美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)。

1.3 標(biāo)本采集 所有患者均行標(biāo)準(zhǔn)大骨瓣開顱術(shù)，顱骨鉆孔，銑刀銑開骨瓣，切開硬腦膜，清除血腫和挫傷腦組織，將取下的挫傷水腫的腦組織作為損傷組標(biāo)本，同一患者顳極減壓獲得的相對(duì)正常腦組織作為對(duì)照組標(biāo)本。每例標(biāo)本均取兩份，一份放入4%的多聚甲醛溶液中固定24h后制作成蠟塊，用于免疫組化檢測(cè)；另一份保存于液氮罐中，用于real-time PCR檢測(cè)。

1.4 免疫組化檢測(cè) 石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化?？乖迯?fù)后3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10min。滴加1︰60的AQP-4一抗4℃過(guò)夜,滴加山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體，37℃孵育40 min。二氨基聯(lián)苯胺顯色液顯色1～3 min，顯微鏡下控制反應(yīng)。Harris蘇木素液復(fù)染細(xì)胞核1min。細(xì)胞膜呈黃色或黃棕色，細(xì)胞核呈藍(lán)色為陽(yáng)性。每個(gè)石蠟塊任意選一張免疫組化染色切片，每張切片在挫傷與水腫帶交界區(qū)隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野（×200），并拍照，用Image-ProPlus5.0專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，測(cè)量免疫組化染色的平均光密度值（OD值)。OD值越大，AQP-4表達(dá)量越大。

1.5 real-time PCR檢測(cè) Trirol試劑提取RNA，計(jì)算RNA含量及鑒定純度。然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用特異性引物擴(kuò)增目的基因。引物由上海輝睿生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成（表1）。real-time PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃5min，94℃變性15s，退火溫度下退火20s，60℃延伸45s，循環(huán)擴(kuò)增40次，60℃檢測(cè)熒光值。反應(yīng)結(jié)束后，由電腦自動(dòng)得出熒光反應(yīng)曲線，輸出各測(cè)量標(biāo)本AQP-4和GAPDH的閾循環(huán)（threshold cycle，CT）值，以GAPDH為參照，計(jì)算方法為：△CT=CT（目的基因）-CT（參照基因GAPDH），△△CT=△CT（損傷組）-△Ct（對(duì)照組），2-△△CT表示目的基因RNA的相對(duì)量。

表1 目的基因的引物序列及反應(yīng)條件

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有計(jì)量資料用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，組內(nèi)不同時(shí)點(diǎn)的比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測(cè) 對(duì)照組腦組織細(xì)胞排列整齊。損傷組可見(jiàn)損傷中心細(xì)胞壞死，血管破裂出血，血管周圍呈空泡樣改變，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)不整，排列紊亂，局部有大量小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)，周圍細(xì)胞水腫明顯，深部白質(zhì)亦有出血、水腫表現(xiàn)。AQP-4主要分布于軟腦膜、與血管接觸的星形膠質(zhì)細(xì)胞足突膜及腦室系統(tǒng)的室管膜上（圖1、2），損傷組挫傷周圍水腫腦組織中AQP-4的OD值均高于同一時(shí)點(diǎn)的對(duì)照組（P＜0.05），并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，AQP-4的表達(dá)量也增加（P＜0.01），而對(duì)照組各點(diǎn)AQP-4的表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），詳見(jiàn)表2。

2.2 real-time PCR檢測(cè) 兩組腦組織中均檢測(cè)到AQP-4 mRNA的表達(dá)。對(duì)照組各時(shí)點(diǎn)AQP-4 mRNA的表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。在同一時(shí)點(diǎn)，損傷組挫傷周圍水腫腦組織中AQP-4 mRNA的表達(dá)量均高于對(duì)照組（P＜0.01），并且隨著損傷時(shí)間的延長(zhǎng)，AQP-4mRNA的表達(dá)量也增加（P＜0.01），詳見(jiàn)表3。

圖1 損傷組AQP-4免疫組化染色（×200）

圖2 對(duì)照組AQP-4免疫組化染色（×200）

表2 兩組標(biāo)本AQP-4表達(dá)量的變化及比較

表3 兩組標(biāo)本中AQP-4 mRNA表達(dá)量的變化及比較

3 討論

腦水腫是顱腦創(chuàng)傷后最常見(jiàn)也是最嚴(yán)重的繼發(fā)性損傷，其病理改變是過(guò)多的水分積聚在腦細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外間隙，引起腦體積增大、重量增加、顱內(nèi)壓增高、腦疝甚至死亡。但目前對(duì)腦水腫的治療僅限于高滲性脫水和外科手術(shù)治療[2]。AQPs是近二十年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)膜通道蛋白家族。迄今為止，已從哺乳動(dòng)物組織中克隆出了13種水通道蛋白，它們廣泛分布于機(jī)體不同組織器官中，在介導(dǎo)水跨細(xì)胞膜的流動(dòng)中起關(guān)鍵作用[3]。其中AQP-4在腦內(nèi)分布廣泛，與腦水腫關(guān)系密切。參與出血性、缺血性腦水腫的形成,并在腦水腫形成過(guò)程中起關(guān)鍵性作用[4]。AQP-4是腦膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接的組成部分[5]，與腦的血液灌注及水腫的形成和消退有著密切的關(guān)系，對(duì)調(diào)節(jié)體內(nèi)水的代謝和維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)水代謝的平衡有重要的意義。AQP-4廣泛存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞和室管膜細(xì)胞，遍及全腦和脊髓，尤其是在緊貼腦脊液、腦室系統(tǒng)的軟腦膜和室管膜表面[6]。

Sun等[7]發(fā)現(xiàn)自由落體致大鼠腦損傷24h后，損傷區(qū)腦水腫程度最顯著，AQP-4的表達(dá)在損傷區(qū)腫脹的星形膠質(zhì)細(xì)胞上明顯上調(diào)，在周邊臨近區(qū)下調(diào)，在遠(yuǎn)處無(wú)明顯變化，因此認(rèn)為AQP-4的上調(diào)可能是引起損傷區(qū)腦水腫的主要途徑和原因，AQP-4促進(jìn)了腦水腫的形成。

雖然目前的實(shí)驗(yàn)研究已較深入，但大多僅限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，較少對(duì)臨床顱腦外傷標(biāo)本進(jìn)行AQP-4的檢測(cè)，了解其變化規(guī)律。根據(jù)CT影像學(xué)資料，急性顱腦損傷后，在挫傷腦組織周圍會(huì)形成一低密度的水腫帶，且隨著出血時(shí)間延長(zhǎng)，水腫范圍逐漸擴(kuò)大，最終導(dǎo)致腦組織受壓形成高顱內(nèi)壓甚至腦疝，造成二次損傷。本研究結(jié)果顯示：在顱腦損傷后各個(gè)時(shí)點(diǎn)挫傷周圍水腫腦組織中AQP-4的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組的正常組織。并且隨著損傷時(shí)間的延長(zhǎng)，AQP-4的表達(dá)量也增加，說(shuō)明AQP-4的異常表達(dá)伴隨著腦水腫而存在。已有研究發(fā)現(xiàn)，顱腦損傷后腦組織含水量增加，AQP-4表達(dá)量增高，血-腦屏障通透性增加，三者的變化趨勢(shì)一致。而且AQP-4表達(dá)量的變化與血-腦屏障通透性增加呈正相關(guān)，這表明三者之間關(guān)系密切。顱腦損傷后AQP-4表達(dá)量上調(diào)可能引起血-腦屏障通透性增加，兩者的變化又導(dǎo)致腦組織含水量的增加[8]。

綜上所述，急性顱腦損傷后腦水腫的發(fā)生、發(fā)展與AQP-4的表達(dá)、血-腦屏障的通透性關(guān)系密切。AQP-4是水分子轉(zhuǎn)移的直接通路或載體，是膠質(zhì)細(xì)胞與腦脊液以及血管之間的水調(diào)節(jié)和運(yùn)輸?shù)闹匾Y(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，以AQP-4作為治療的靶向，可能有助于臨床上防止腦水腫的發(fā)生。Kleindienst等[9]用蛋白激酶C的激活劑調(diào)節(jié)AQP-4的表達(dá)并獲得成功。也有研究表明地塞米松在大鼠腦出血模型中下調(diào)了AQP-4的表達(dá)，從而降低了腦水腫的程度[10]。

腦水腫的形成是一種多機(jī)制、多因素參與的病理過(guò)程，AQP-4可能僅為其中重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，其過(guò)程并未被完全闡明。目前對(duì)AQP-4與顱腦損傷后腦水腫關(guān)系的研究才剛剛起步，還需要有更多的基礎(chǔ)和臨床研究來(lái)證實(shí)。本研究以臨床患者的手術(shù)標(biāo)本為研究對(duì)象，直接從臨床水平探討AQP-4與急性顱腦損傷腦水腫的關(guān)系，這對(duì)于急性顱腦損傷腦水腫的防治具有重要的臨床意義。

[1]Bor-Seng-Shu E,de Lima Oliveira M,Teixeira M J.Traumatic brain injury and metabolish[J].Neurosurg,2010,112(6):1351-1353.

[2]劉偉國(guó),楊小鋒.神經(jīng)損傷的臨床與基礎(chǔ)[M].杭州:浙江大學(xué)出版社, 2008:48-52.

[3]Magni F,Sarto C,Ticozzi D,et al.Proteomic knowledge of human aquaporins[J].Proteomics,2006,6(20):5637-5686.

[4]Bienert G P,Moller A L,Kristiansen K A,et al.Specific aquaporins facilitate the diffusion of hydrogen peroxide across membranes [J].Biol Chem,2007,282(2):1183-1192.

[5]Hiroaki Y,Tani K,Kamegawa A.Implications of the aquaporin-4 structure on array formation and cell adhesion[J].Mol Biol,2006, 355:628-639．

[6]Bungeroth M,Schiffbauer H,Schabitz W,et al.The role of aquaporin-4 polymorphisms in the development of brain edema after middle cerebral artery occlusion[J].Stroke,2008,39(4):1333-1335.

[7]Sun M C,Honey C R,Berk C,et al.Regulation of aquaporin-4 in a traumatic brain injury model in rats[J].Neurosurg,2003,98(3): 565-574.

[8]崔向?qū)?尹嶺,王玉來(lái),等.水通道蛋白4在大鼠創(chuàng)傷性腦水腫中的作用機(jī)制[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2005,11(9):719-721．

[9]Kleindienst A,Fazzina G,Amorini A M,eI al.Modulation of AQP-4 expression by the protein kinase C activator phorbol myristale acetate decreases ischemiainduced brain edema[J].Acta Neurochir Suppl,2006,96:393-397.

[10]Gu Y T,Zhang H,Xue Y X.Dexamethasone treatment modulates aquaporin-4 expression after intracerebral hemorrage in rats [J].Neuroaci Lett,2007,413(2):126-131.

Changes of aquaporin-4 expression in cerebral tissue after traumatic brain injury

Objective To assess the changes of aquaporin-4(AQP-4)expression in cerebral tissue after traumatic brain injury.Methods The cerebral tissue samples were obtained from 27 patients with traumatic brain injury during the operation,including contusive and edematous brain tissue(injury group)and the normal brain tissue in temporal pole after surgical depressurization(control group).The expressions of AQP-4 protein and mRNA in cerebral tissue samples were detected by immunohistochemieal technique and real-time PCR. Results The expression levels of AQP-4 protein and mRNA in the injury group were significantly higher than those in the control group(P＜0.05),particularly in the edematous tissues on 24h after traumatic injury. Conclusion The results suggest that the up-regulated expression of AQP-4 in the edematous brain tissues around the contusion may be involved in the formation and development of cerebral edema after traumatic brain injury．

Brain injury,traumatic Cerebral edema Aquaporin-4

2013-01-18）

（本文編輯：沈叔洪）

寧波市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2010A610065）；浙江省衛(wèi)生適宜技術(shù)成果轉(zhuǎn)化計(jì)劃（2011ZHA009）

315300 慈溪市人民醫(yī)院神經(jīng)外科

湯崇輝，E-mail：tangegg@163.com