丁金旺 羅定存 葉柳青 鄧甬川 王克義 張臥 潘鋼 周美琪 秦衛(wèi)民蔡菊芳

乳腺癌患者血清中TBX3的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

丁金旺 羅定存 葉柳青 鄧甬川 王克義 張臥 潘鋼 周美琪 秦衛(wèi)民蔡菊芳

目的 探討乳腺癌患者血清中TBX3的表達(dá)水平，探討其與臨床病理特征的關(guān)系。 方法 采用ELISA法檢測(cè)142例乳腺癌患者、70例乳腺良性疾病患者和80例健康女性血清中TBX3的表達(dá)水平，并比較3者之間的差異，分析血清TBX3與乳腺癌患者年齡、月經(jīng)狀態(tài)、組織學(xué)分級(jí)、腋窩淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移、TNM分期以及雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人表皮生長(zhǎng)因子受體2（Her-2）、細(xì)胞核增殖抗原（Ki-67）之間的相關(guān)性。結(jié)果 142例乳腺癌患者血清TBX3水平為2.13（1.01-6.15）ng/ml，顯著高于健康對(duì)照組[1.60（0.99-2.18）ng/ml]及良性對(duì)照組[1.58（0.71-3.18）ng/ml]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。血清TBX3表達(dá)水平與乳腺癌患者年齡、月經(jīng)無關(guān)，但隨著乳腺癌組織學(xué)級(jí)別增加、TNM分期進(jìn)展、出現(xiàn)腋窩淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移而顯著升高。此外，ER陽(yáng)性及Her-2過表達(dá)者血清TBX3表達(dá)水平較ER陰性及Her-2低表達(dá)者明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。Ki-67≥14%者與Ki-67＜14%者、PR陽(yáng)性者與PR陰性者之間血清TBX3表達(dá)水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。 結(jié)論血清TBX3在乳腺癌患者血清中高表達(dá)，且與乳腺癌組織學(xué)分級(jí)、TNM分期、腋窩淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移、ER及Her-2密切相關(guān)，提示血清TBX3可能可以作為乳腺癌臨床診斷、預(yù)后判斷及隨訪監(jiān)測(cè)的分子標(biāo)記物。

乳腺癌 血清 TBX3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 分子標(biāo)記物

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率持續(xù)上升并呈年輕化，嚴(yán)重危害著廣大婦女的健康。乳腺癌受多種異?；蛘{(diào)控，特別是與原癌基因的激活和抑癌基因失活密切相關(guān)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在已確認(rèn)的與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的諸多基因中，如p53、人表皮生長(zhǎng)因子受體2（Her-2）等基因，人們又發(fā)現(xiàn)了一些新的基因，如TBX3。隨著研究的深入，TBX3已成為近年來乳腺癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。有研究證實(shí)，乳腺癌組織和細(xì)胞中存在TBX3高表達(dá)[1-2]，提示TBX3可能與乳腺的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。筆者采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)并比較乳腺良、惡性疾病患者和健康女性血清中TBX3的表達(dá)水平，分析其與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系，以探討TBX3在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2010-09—2012-03杭州市第一人民醫(yī)院及浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院的212例乳腺疾病患者資料（杭州市第一人民醫(yī)院127例，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院85例），包括年齡、月經(jīng)狀態(tài)、病理類型、組織學(xué)分級(jí)、腋窩淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、臨床分期、雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、Her-2及細(xì)胞核增殖抗原（Ki-67）表達(dá)狀況等?；颊呔鶠榕?，按組織病理學(xué)結(jié)果分兩組，即乳腺癌組與良性對(duì)照組。乳腺癌組142例，年齡30～80（50.98±9.57）歲；55.63%的患者未絕經(jīng)。根據(jù)美國(guó)AJCC第7版乳腺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[3]，0期2例，Ⅰ期15例，Ⅱ期41例，Ⅲ期20例，Ⅳ期64例；病理類型包括浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌130例，浸潤(rùn)性小葉癌4例，導(dǎo)管內(nèi)癌2例，黏液癌2例，髓樣癌2例，神經(jīng)內(nèi)分泌癌1例，化生性癌1例。良性對(duì)照組70例，年齡28～69（46.46±9.58）歲；包括乳腺纖維腺瘤42例，乳腺增生性病變13例，導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤11例，分葉狀腫瘤2例，乳管擴(kuò)張癥2例。另?yè)裢诤贾菔械谝蝗嗣襻t(yī)院行健康體檢的80例女性作為健康對(duì)照組，年齡22～81（42.05±14.69）歲。排除各種良、惡性腫瘤，且無先天性疾病史。均得到患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血清標(biāo)本收集與保存 采集患者術(shù)前或化療前空腹靜脈血4ml于血清分離管內(nèi)，室溫完全凝固，3 000r/min離心10min后分離血清，置于-70℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。健康?duì)照組的血清標(biāo)本采用同樣方法。

1.2.2 血清TBX3檢測(cè) 采用雙抗體夾心-ELISA法定量檢測(cè)上述各組血清TBX3的表達(dá)水平，試劑盒購(gòu)自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司（產(chǎn)品編號(hào)：E97858Hu）。本研究采取盲法、復(fù)孔檢測(cè)，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 乳腺癌組織ER、PR、Ki-67陽(yáng)性及Her-2過表達(dá)判斷標(biāo)準(zhǔn) 本研究采用S-P法檢測(cè)ER、PR、Ki-67及Her-2表達(dá)情況，ER、PR蛋白的表達(dá)以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色，根據(jù)半定量法將結(jié)果分為“-”和“+～+++”4個(gè)級(jí)別，其中將“+”以上定義為陽(yáng)性。Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞為核境界清晰的棕褐色顆粒沉著細(xì)胞，以切片中陽(yáng)性細(xì)胞比例≥14%定義為陽(yáng)性。Her-2蛋白的表達(dá)以細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色，采用半定量法，結(jié)果分為“-”和“+～+++”4個(gè)級(jí)別，其中將“+++”定義為Her-2過表達(dá)，“+”及“-”定義為Her-2低表達(dá)，“++”進(jìn)一步行免疫熒光原位雜交法（FISH）檢測(cè)，以Her-2基因/17號(hào)染色體比值＞2.2確定為過表達(dá)，否則為低表達(dá)。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料呈偏態(tài)分布，以M（QR）表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 3組血清TBX3的表達(dá)水平的比較 見表1。

表1 3組血清TBX3的表達(dá)水平的比較

由表1可見，乳腺癌組血清TBX3的表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組及良性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01），但在健康對(duì)照組與良性對(duì)照之間血清TBX3表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 乳腺癌患者血清TBX3表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 見表2。

由表2可見，血清TBX3的表達(dá)在年齡≤50歲者與＞50歲者、絕經(jīng)前與絕經(jīng)后的乳腺癌患者中差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。與組織學(xué)1+2級(jí)患者相比，組織學(xué)3級(jí)的乳腺癌患者血清TBX3表達(dá)水平顯著增高，有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者血清TBX3表達(dá)水平顯著高于無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者，Ⅲ+Ⅳ期患者血清TBX3表達(dá)水平顯著高于0+Ⅰ+Ⅱ期患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。以上結(jié)果表明，血清TBX3的表達(dá)與乳腺癌患者的年齡、月經(jīng)狀態(tài)無關(guān)，但與組織學(xué)分級(jí)、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)。

2.3 血清TBX3與乳腺癌常見分子標(biāo)記物之間的關(guān)系 見表3。

由表3可見，142例乳腺癌患者ER、PR陽(yáng)性率分別為69.01%（98/142）、67.61%（96/142），Her-2過表達(dá)率為33.10%（47/142）。142例乳腺癌患者中有94例進(jìn)行了Ki-67的檢測(cè)，結(jié)果Ki-67≥14%者占62.77%（59/ 94）。ER陽(yáng)性及Her-2過表達(dá)者血清TBX3表達(dá)水平較ER陰性及Her-2低表達(dá)者明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。Ki-67≥14%者血清TBX3表達(dá)水平雖然高于Ki-67＜14%者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。PR陽(yáng)性者與PR陰性者血清TBX3的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 乳腺癌患者血清TBX3的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

表3 血清TBX3與乳腺癌常見分子標(biāo)記物之間的關(guān)系

3 討論

TBX3基因是調(diào)控發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員之一，通過其表達(dá)產(chǎn)物TBX3蛋白調(diào)控哺乳動(dòng)物的組織發(fā)育和細(xì)胞增殖。有研究表明，TBX3通過p19ARF（人p14ARF）/MdM2/p53和p21WAF1/CIP1等信號(hào)途徑抑制抑癌基因p53及p21的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。因此，TBX3持續(xù)表達(dá)或高表達(dá)時(shí)細(xì)胞將繞過衰老途徑而出現(xiàn)永生化和癌變，最終導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。

現(xiàn)已明確，TBX3基因的缺失或突變是導(dǎo)致人類尺骨-乳腺綜合征（ulnar-mammary syndrome，UMS）的主要原因[1]，UMS是一種嚴(yán)重的常染色體顯性遺傳性疾病，乳腺發(fā)育障礙（包括發(fā)育不全和不發(fā)育）是該綜合征的重要特征，提示TBX3基因參與乳腺的正常發(fā)育。Platonova等[4]發(fā)現(xiàn)TBX3是調(diào)節(jié)乳腺細(xì)胞生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)水平調(diào)控著乳腺細(xì)胞增殖的程度。近年來的研究進(jìn)一步顯示，TBX3在乳腺癌組織和細(xì)胞中均呈高表達(dá)，而大量表達(dá)的TBX3可以從乳腺癌組織和細(xì)胞中釋放入血并引起血TBX3水平升高[1-2]。本研究采用ELISA法檢測(cè)212例乳腺疾病患者和80例健康女性的血清TBX3水平，結(jié)果表明乳腺癌患者血清TBX3表達(dá)水平顯著高于良性對(duì)照組及健康對(duì)照組，而健康對(duì)照組與良性對(duì)照之間血清TBX3表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），和既往研究結(jié)果類似[5-6]。這不僅從血清學(xué)角度驗(yàn)證了TBX3在乳腺癌的發(fā)生和演進(jìn)過程中可能發(fā)揮著重要作用，而且說明血清TBX3的檢測(cè)或可成為臨床鑒別乳腺良、惡性疾病的一個(gè)新的診斷方法。

有文獻(xiàn)報(bào)道，隨著乳腺癌進(jìn)展，TBX3在癌組織中的表達(dá)明顯增強(qiáng)[7]。陳忠華等[8]在TBX3與乳腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，有轉(zhuǎn)移的癌組織TBX3表達(dá)水平明顯強(qiáng)于非轉(zhuǎn)移的癌組織（P＜0.05）。而葉英海等[9]研究則顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中TBX3的陽(yáng)性率為86.21%（25/29），明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽(yáng)性率58.33%（14/ 24）（P＜0.05）。本研究中乳腺癌患者伴有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者血清TBX3表達(dá)水平顯著高于無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者（P＜0.01），這說明血清TBX3和組織學(xué)TBX3一樣，其表達(dá)水平隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而不斷升高。最近一些研究闡明了TBX3在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的機(jī)制，持續(xù)高表達(dá)的TBX3抑制鈣黏蛋白的表達(dá)，致使腫瘤細(xì)胞黏附性下降，細(xì)胞易于遷移和浸潤(rùn)，從而出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[2，10]。此外，筆者通過分析血清TBX3水平與TNM分期及組織分級(jí)的關(guān)系還發(fā)現(xiàn)，組織學(xué)3級(jí)、Ⅲ+Ⅳ期的乳腺癌患者血清TBX3水平較組織學(xué)1+2級(jí)、TNM分期0+Ⅰ+Ⅱ期患者顯著增高，這提示血清TBX3的表達(dá)水平與組織學(xué)分級(jí)、TNM分期也存在密切關(guān)系。而淋巴結(jié)(遠(yuǎn)處)轉(zhuǎn)移、TNM分期及組織學(xué)分級(jí)等臨床病理因素均是判斷乳腺癌預(yù)后的重要依據(jù)，因此，筆者推斷血清TBX3表達(dá)水平不僅可以反映疾進(jìn)展情況，還可以作為乳腺癌預(yù)后判斷及隨訪監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)之一。

激素受體（ER、PR）和Her-2是目前臨床上判斷乳腺癌預(yù)后及指導(dǎo)治療方案最重要的分子標(biāo)記物。本研究中，ER、PR陽(yáng)性率分別為69.01%、67.61%，Her-2過表達(dá)率為33.10%，與Althuis等[11]和Fiegl等[12]的研究結(jié)果基本一致。有研究報(bào)道，TBX3的表達(dá)與激素受體及Her-2的狀態(tài)有關(guān)[9]。Fan等[13]對(duì)已知ER狀態(tài)的27例乳腺癌細(xì)胞株研究后發(fā)現(xiàn)，ER陽(yáng)性的癌細(xì)胞TBX3的過表達(dá)比例及表達(dá)水平均高于ER陰性者。國(guó)內(nèi)葉英海等[9]研究發(fā)現(xiàn)，ER或Her-2陽(yáng)性的乳腺癌組織中TBX3的陽(yáng)性率明顯高于ER陰性者及Her-2陰性者（84.38%、57.14%，93.75%、64.86%）。而劉志祥[6]則認(rèn)為TBX3的表達(dá)水平與Her-2過表達(dá)正相關(guān)，但與ER陽(yáng)性表達(dá)負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，ER陽(yáng)性及Her-2過表達(dá)者血清TBX3表達(dá)水平較ER陰性及Her-2低表達(dá)者明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。Ki-67是乳腺癌細(xì)胞表達(dá)的一種核抗原，在乳腺癌診斷及判斷預(yù)后方面也具有重要意義[14]，因此，2011年的St.Gallen會(huì)議將Ki-67指數(shù)作為乳腺癌分子分型的指標(biāo)之一[15]。本研究94例患者中，Ki-67陽(yáng)性者為59例，陰性者為35例，血清TBX3水平在兩組間雖然未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但仍可見血清TBX3在Ki-67陽(yáng)性組的表達(dá)高于陰性組的趨勢(shì)，可能與本組病例數(shù)不足有關(guān)，仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究。

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Serum TBX3 levels in patients with breast cancer and its relationship with clinicopathological characteristics

Objective To investigate serum T-box 3 (TBX3)levels in patients with breast cancer and its relationship with clinical and pathological characteristics.Methods Serum TBX3 levels were determined by Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)in 142 patients with breast cancer,70 patients with benign breast lesions and 80 healthy subjects.The correlations of serum TBX3 level with age,menstruation status,histological grade,axillary lymph node and distance metastasis,TNM staging and ER,PR,Ki-67,Her-2 levels were analyzed. Results The concentration of serum TBX3 was 2.13(1.01-6.15)ng/ml in patients with breast cancer and significantly higher than those in healthy subjects[1.60(0.99-2.18)ng/ml,P＜0.01]and patients with benign breast lesions [1.58(0.71-3.18)ng/ml,P＜0.05].Serum TBX3 levels in breast cancer patients were positively correlated with the histological grading,TNM staging,axillary lymph node and distance metastasis,but not correlated with the menstruation status and age of patients.Furthermore,serum TBX3 in ER positive and Her-2 over-expressed patients were significantly higher than those in ER negative and Her-2 low-expressed ones(P＜0.05),while there was no significant difference in serum Tbx3 between the PR positive and PR negative,Ki-67 positive and Ki-67 negative patients(P＞0.05). Conclusion Serum TBX3 is over-expressed in breast cancer,which is significantly correlated with histological grade,axillary lymph node and distance metastasis,TNM staging,ER and Her-2 status,indicating that it may serve as a biomarker for breast cancer and have potential clinical applications.

Breast cancerSerum T-box 3(TBX3) Enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)Biomarker

2012-11-01）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

杭州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20100633B05）

310006 杭州市第一人民醫(yī)院腫瘤外科（丁金旺、羅定存、張臥、潘鋼、秦衛(wèi)民），中心實(shí)驗(yàn)室（王克義），體檢中心（蔡菊芳）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院腫瘤外科（鄧甬川、周美琪）；浙江省腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科（葉柳青）

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