葉俏 沈潔 李紅勝

血漿循環(huán)DNA濃度在原發(fā)性干燥綜合征和系統(tǒng)性紅斑狼瘡診治中的意義

葉俏 沈潔 李紅勝

目的 比較原發(fā)干燥綜合征（pSS）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者外周血漿中循環(huán)DNA（cDNA）濃度的差異性，探討cDNA濃度在pSS、SLE診治中的意義。 方法 選用人類基因組管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）設(shè)計引物，測定pSS、SLE及健康對照組中血漿cDNA濃度，同時測定血沉（ESR）、C-反應(yīng)蛋白（CRP）、免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）并評定不同疾病的活動指數(shù)和損害指數(shù)，分析血漿cDNA濃度與疾病活動性、相關(guān)參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果 pSS組cDNA濃度[（368.24±196.68）ng/ml]明顯高于SLE組[（244.51±164.10）ng/ml]及健康對照組[（24.56±16.76）ng/ml]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；pSS組中的cDNA濃度值與干燥綜合征活動指數(shù)（SSDAI）呈正相關(guān)（P＜0.05），與干燥綜合征損害指數(shù)（SSDDI）無相關(guān)性（P＞0.05）；SLE組中cDNA濃度值與SLE活動指數(shù)（SLEDAI）無相關(guān)性（P＞0.05）。 結(jié)論 cDNA濃度可作為pSS與SLE鑒別指標之一，pSS患者cDNA濃度與SSDAI呈正相關(guān)，可作為pSS疾病活動性觀察指標之一。

血漿循環(huán)DNA 原發(fā)性干燥綜合征 系統(tǒng)性紅斑狼瘡 干燥綜合征活動指數(shù) 干燥綜合征損害指數(shù) 系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動指數(shù)

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2010-08—2013-02本院住院與門診pSS患者36例，男3例，女33例，年齡24～77歲，平均（52.3±13.8）歲。初發(fā)14例，非初發(fā)22例，入組病程1個月～30年，平均（45.9±66.2）個月；均符合2002年干燥綜合征國際分類標準[1]。選擇本院住院與門診的SLE患者（排除繼發(fā)干燥綜合征患者）共29例，均為女性，年齡18～63歲，平均（38.3±12.2）歲。初發(fā)10例，非初發(fā)19例；入組病程2d～30年，平均（50.1±88.3）個月。診斷符合美國風(fēng)濕病學(xué)會（ACR）1982年推薦的SLE分類標準[2]。收集本院職工健康體檢者30例作為健康對照組，男2例，女28例，年齡29～66歲，平均（46.6±10.2）歲。排除感染、肝炎、結(jié)核、創(chuàng)傷、應(yīng)激、嚴重的心血管及腦血管疾病急性期等可致cDNA升高患者。3組性別及病程的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而年齡的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但是cDNA值是個獨立的因素，不受性別和年齡影響[3]，因此不影響cDNA的結(jié)果。

1.2 主要試劑和儀器 微量樣品DNA提取試劑盒、DH5α感受態(tài)細菌（天根生化科技有限公司），TaKaRa SYBR Premix Ex Taq、TaKaRa Ex Taq、TaKaRa DNA 6Loading Buffer、aKaRa DL2000 DNA Marker（大連寶生物工程有限公司），pGEM-T Vector Systems I(美國Promega公司)，酵母提取物、胰蛋白胨（上海生工生物工程有限公司），GenClean柱式瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司），LightCycler 480（Roche Diagnostics）實時定量儀（瑞士羅氏公司），Immage 800測定蛋白分析儀（美國Beckman Coulter公司）。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 取靜脈血5ml置于EDTA抗凝管中，以800g離心力離心10min后將上清血漿吸置清潔離心管，再離心10min，取上清液，避免攪動沉淀層。上清液繼續(xù)離心10min，使血漿中的不容物沉淀。完全去除血細胞成分置干燥潔凈凍存管中，-80°C低溫冰箱保存?zhèn)錂z，統(tǒng)一檢測。

1.3.2 DNA的提取 采用血液基因組小量提取試劑盒（BloodGen Mini Kit）抽提DNA。抽提方法依據(jù)試劑盒使用說明：取200μl血漿樣品至離心柱中，加入Protease，采用50μl Buffer溶解提取的DNA，-20℃保存。

1.3.3 血漿DNA的擴增 采用LightCycler 480（Roche Diagnostics）進行實時定量檢測，試劑使用SYBR Green PCR kit（TaKaRa SYBR Premix Ex Taq），實時定量PCR擴增定量管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH），GAPDH引物序列：Primer Forward：5＇-CTGGGCTACACTGAGCACC-3＇，Primer Reverse：5＇-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3＇，PCR產(chǎn)物長度186dp。引物由上海生工生物工程有限公司合成，擴增反應(yīng)體系為10μl，擴增反應(yīng)采用三步法PCR擴增標準程序：50個循環(huán)數(shù)，預(yù)變性：95℃30s，PCR反應(yīng)：（50個循環(huán)）95℃5s，55℃30s，72℃30s。

1.3.4 標準品的制備 采用正常人血漿提取質(zhì)粒，并檢測質(zhì)粒吸光度（OD）值，通過所得OD值計算核酸質(zhì)量，采用跨內(nèi)含子的基因GADPH的引物擴增樣品，測得樣品血清中核酸的具體含量，并對質(zhì)粒進行10倍的梯度稀釋，得到濃度相差10倍的一系列標準品備用，擴增具有不同底物濃度的標準品（0.035、0.35、3.5、35、200ng），利用各標準品擴增所得Ct值與相應(yīng)標準品濃度的對數(shù)值進行線性擬合，得到樣品模板量計算公式為：X=（Y-28.69235）/-3.62966（Y：Ct值，X：模板量），根據(jù)公式計算標本cDNA含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)分析定量資料采用Pearson相關(guān)分析，等級資料采用Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 3組cDNA濃度值的比較 見表1。

表1 3組cDNA濃度值比較

由表1可見，3組血漿cDNA濃度值中pSS組最高，SLE組次之，且pSS組與SLE組cDNA濃度值明顯高于健康對照組，3組間cDNA濃度值的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.2 pSS組、SLE組cDNA濃度值與各指標間的相關(guān)性分析 見表2、3。

表2 pSS組cDNA濃度值與各指標間的相關(guān)性分析

表3 SLE組cDNA濃度值與各指標間的相關(guān)性分析

由表2、3可見，pSS組中cDNA濃度值與干燥綜合征活動指數(shù)（SSDAI）、IgG呈正相關(guān)（P＜0.05），與其他指標均無相關(guān)性（均P＞0.05）；SLE組中cDNA濃度值與其他指標均無相關(guān)性（均P＞0.05）。

3 討論

cDNA又稱為游離DNA（cell-free DNA），1948年第1次被證實存在；1986年Tan首次報道在紅斑狼瘡患者中cDNA升高，cDNA才在免疫性疾病中得到關(guān)注。正常人血漿、血清中存在微量游離DNA，擴增這些DNA發(fā)現(xiàn)，來源于各條染色體的片段數(shù)與該染色體的大小有關(guān)[4]，片段中內(nèi)含子、外顯子、插入序列的比例與全基因組構(gòu)成比相似，因此cDNA與疾病密切相關(guān)。cDNA作為惡性腫瘤的監(jiān)測生物學(xué)標記，在炎癥、疼痛、慢性疾病等情況下也會升高[5-6]。本試驗利用熒光定量PCR的方法檢測樣品血清中的游離核酸含量，并以GADPH作為游離核酸定量的指標測定cDNA，分析cDNA在pSS及SLE中的價值。

本研究中測定了pSS、SLE患者外周血漿的cDNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pSS組患者cDNA濃度值為（368.24±196.68）ng/ml，SLE患者cDNA濃度值為（244.51±164.10）ng/ml，而正常者cDNA濃度值為（24.56±16.76）ng/ml，3組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與Bartoloni等[7]報道相一致。在pSS、SLE患者中，cDNA的升高可能與細胞的凋亡壞死、活性細胞的產(chǎn)生、DNA片段的產(chǎn)生及清除不平衡等有關(guān)。作為免疫調(diào)節(jié)活性的cDNA通過暴露在細胞膜上和（或）細胞內(nèi)cDNA相互作用，識別靶細胞表面結(jié)合的寡脫氧核糖核苷酸（ODN）類似物起作用[8]。健康者的cDNA是由細胞凋亡生成的DNA的小片段，而癌癥患者的cDNA源于細胞壞死、自噬或有絲分裂[9]。在pSS、SLE患者cDNA產(chǎn)生是否有類似于腫瘤產(chǎn)生機制，目前尚不明確。本研究中pSS組患者的cDNA最高,細胞的凋亡也許是形成cDNA升高的主要因素[7]，是否有其他途徑參與cDNA合成，有待進一步研究。

在自身免疫性疾病活動中，T細胞和（或）B細胞自主的克隆，B細胞的自動反應(yīng)、T細胞的克隆和巨噬細胞產(chǎn)生自身免疫性抗體、大量可溶性炎性分子及細胞表面的蛋白質(zhì)，這些物質(zhì)能引起病理生理的紊亂，高選擇性的DNA也是這樣產(chǎn)生，類似于在腫瘤中產(chǎn)生的機制?；罨馨图毎麉⑴c免疫性疾病過程，目前已證實活化的淋巴細胞在有絲分裂下能綜合和分泌核酸和染色體外DNA，這也是cDNA升高原因。在SLE患者中，cDNA高于對照組，在氯喹治療后顯著下降[10]，也證實cDNA在自身免疫性疾病中成為生物學(xué)標記可能。

本研究結(jié)果表明，pSS組中患者cDNA濃度值與SSDAI、IgG成正相關(guān)性（P＜0.05），但是cDNA濃度值與干燥綜合征損害指數(shù)（SSDDI）無相關(guān)性（P＞0.05），因此cDNA值可作為觀察pSS疾病活動性的生物學(xué)指標之一。在SLE組中，cDNA與SLE活動指數(shù)（SLEDAI）并無相關(guān)性（P＞0.05），這能否說明cDNA在兩疾病中是有差別的，能否作為作為pSS與SLE鑒別觀察指標，有待于擴大樣本量及延長觀察時間證實。

綜上所述，cDNA不論在SLE、pSS中均升高，不同疾病之間也有差異，cDNA可能會是pSS與SLE鑒別的一種新的生物學(xué)標記，也可能是pSS活動性觀測指標。

[1]Vitali C,Bombardieri S,Jonsson R,et al.Classification criteria for Sjo gren's syndrome:a revised version of the European criteria proposed by the American-European Consensus Group[J].Ann Rheum Dis,2002,61(6):554-558.

[2]Tan E M,Cohen A S,Fries J F,et al.The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus[J].Arthritis Rheum,1982,25(11):1271-1277.

[3]Arnalich F,Codoceo R,López-Collazo E,et al.Circulating cell-free mitochondrial DNA:a better early prognostic marker in patients with out-of-hospital cardiac arrest[J].Resuscitation,2012,83(7): 162-163.

[4]Suzuki N,Kamataki A,Yamaki J,et al.Characterization of circulating DNA in healthy human plasma[J].Clin Chim Acta,2008,387(1-2): 55-58．

[5]ArnalichF,CodoceoR,López-Collazo E,et al.Circulating cell-free mitochondrial DNA:a better early prognostic marker in patients with out-of-hospital cardiac arrest[J].Resuscitation,2012,83(7): 162-163.

[6]Breitbach S,Tug S,Simon P.Circulating cell-free DNA:an upcoming molecular marker in exercise physiology[J].Sports Med, 2012,42(7):565-586.

[7]Bartoloni E,Ludovini V,Alunnol A,et al.Increased levels of circulating DNA in patients with systemic autoimmune diseases:A possible marker of disease activity in Sjo gren's syndrome[J].Lupus,2011,20(9):928-935.

[8]Cherepanova A V,Bushuev A V,Duzhak T G,et al.Ku protein as the main cellular target of cell-surface-bound circulating DNA[J]. Expert Opin Biol Ther,2012,12(1):35-41.

[9]Delgado P O,Alves B C,Gehrke Fde S,et al.Characterization of cell-free circulating DNA in plasma in patients with prostate cancer[J].Tumour Biol,2013,34(2):983-986.

[10]Cepika A M,Soldo Juresa D,Morovic Vergles J,et al.Decrease in circulating DNA,IL-10 and BAFF levels in newly-diagnosed SLE patients after corticosteroid and chloroquine treatment[J]. Cell Immunol,2012,276(1-2):196-203.

Plasma circulating DNA levels in patients with primary Sjo gren's syndrome and systemic lupus erythematosus

Objective To investigate the plasma circulating DNA（cDNA）levels in patients with primary Sjgren's syndrome(pSS)and systemic lupus erythematosus(SLE),and its clinical significance.Methods The primer was designed by human genome housekeeper gene GAPDH.Levels of cDNA,erythrocyte sedimentation rate(ESR),C-reaction protein(CRP)and immunoglobulin(IgA,IgG and IgM)in each group were detected.Meanwhile,the activity index and damage index of different diseases were assessed,and the relations between cDNA and disease activity were analyzed.Results The levels of plasma cDNA in pSS group(368.24±196.68ng/ml)were apparently higher than those in SLE group(244.51±164.10ng/ml)and normal control group(24.56±16.76ng/ml),and the differences were significant statistically(both P＜0.05).The levels of cDNA in each disease group were significantly higher than those in normal control group (both P＜0.05).In pSS group:cDNA level was positively correlation with Sjgren's syndrome disease activity index(SSDAI)(P＜0.05).But there was no correlation between cDNA concentration and Sjo gren's syndrome disease damage index(SSDDI)(P＞0.05).In SLE group:cDNA level did not correlate with SLE disease activity index(SLEDAI)(P＞0.05).Conclusion The cDNA level may be a valuable indicator for distinguishing pSS from SLE.And it can be taken as one of the disease activity indices of pSS.

Plasma circulating DNA Primary Sjo gren's Syndrome Systemic lupus erythematosus Sjgren's syndrome disease activity index Sjgren's syndrome disease damage index SLE disease activity index

2013-07-16）

（本文編輯：嚴瑋雯）

（本文由浙江省醫(yī)學(xué)會風(fēng)濕病學(xué)分會推薦）

嘉興市科技計劃項目（2013AY21043-11）

314000 嘉興市第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科（葉俏、沈潔），檢驗科（李紅勝）

葉俏，E-mail：lyjxsh_yq32@163.com