王立英 陳春曉 朱新建 項(xiàng)利娟

浙江地區(qū)漢族人群IL-27p28基因多態(tài)性與克羅恩病的相關(guān)性研究

王立英 陳春曉 朱新建 項(xiàng)利娟

目的 探討IL-27p28基因啟動(dòng)子區(qū)g.-964 T＞C、第2外顯子區(qū)g.2905T＞G和第4外顯子區(qū)g.4730T＞C 3個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性與浙江地區(qū)人群克羅恩病（CD）的相關(guān)性。方法 選取75例浙江地區(qū)漢族CD患者（病例組）及80例健康體檢者（對(duì)照組），采用聚合酶鏈反應(yīng)-連接酶檢測(cè)，分析兩組基因型頻率及等位基因頻率。 結(jié)果 對(duì)照組的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。兩組g.-964位點(diǎn)的基因型頻率及等位基因頻率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而g.2905和g.4730位點(diǎn)的基因頻率及等位基因頻率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 結(jié)論 IL-27p28基因多態(tài)位點(diǎn)g.-964 T＞C可能與浙江地區(qū)漢族人群CD易感性有關(guān)，g.2905T＞G和g.4730T＞C多態(tài)性與浙江地區(qū)漢族人群CD無(wú)關(guān)。

IL-27p28 基因多態(tài)性 克羅恩病

克羅恩?。–D）是一種慢性非特異性胃腸道炎癥性疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前認(rèn)為是由環(huán)境、遺傳、感染、免疫等多種因素相互作用所致。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腸道黏膜免疫異常在炎癥性腸?。↖BD）發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[1]，其中細(xì)胞因子調(diào)節(jié)在介導(dǎo)這一免疫反應(yīng)異常中扮演重要角色。IL-27是新近發(fā)現(xiàn)的IL-12家族成員之一，與IL-12具有相似的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，參與多種免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤等疾病的免疫調(diào)節(jié)過程[2]。目前已知，IL-27p28基因的3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)分別為：?jiǎn)?dòng)子區(qū)g.-964 T＞C、第2外顯子區(qū)g.2905T＞G和第4外顯子區(qū)g.4730T＞C。2009年，Li等[3]韓國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn)，位于IL-27p28基因多態(tài)性可能與韓國(guó)人群CD易感性相關(guān)。筆者在這一發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上通過分析該位點(diǎn)多態(tài)性，探討其與浙江地區(qū)漢族人群CD發(fā)病的相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2007-01—2011-12在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院（40例）和上虞市人民醫(yī)院消化內(nèi)科（35例）就診或住院且臨床資料完整、彼此無(wú)血緣關(guān)系的75例漢族CD患者，其中男41例，女34例，年齡8～67歲，平均（37.43±12.45）歲；平均病程（5.37±4.29）年；CD活動(dòng)指數(shù)183.47±53.61。選擇同期健康體檢者80例作為對(duì)照組，其中男45例，女35例，年齡18～60歲，平均（36.21±11.54）歲。CD的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)炎癥性腸病協(xié)作組制定的《中國(guó)炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識(shí)意見》[4]。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）非漢族人口；（2）合并其他自身免疫性疾??；（3）嚴(yán)重心、肺、肝、腎功能損害和神經(jīng)、精神疾??；（4）糖尿病以及其他內(nèi)分泌系統(tǒng)疾??；（5）近期有明確感染病史：近1個(gè)月曾使用糖皮質(zhì)激素；近3個(gè)月曾使用免疫抑制劑；（6）服用避孕藥的育齡女性、孕期和哺乳期婦女；（7）創(chuàng)傷患者。本研究經(jīng)浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院和上虞市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。兩組性別、年齡的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采集EDTA抗凝靜脈血2ml，使用臨床樣品基因組DNA小量抽提試劑盒（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）提取白細(xì)胞基因組DNA，溶解于TE緩沖液，定量后-20℃保存。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)-連接酶檢測(cè)（PCR-LDR） IL-27g.-964T＞C、g.2905T＞G和g.4730T＞C位點(diǎn)多態(tài)性采用PCR-LDR技術(shù)分析。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為基因組DNA 1μl、上下游引物各0.25μl（10μmol/L）、Taq酶0.2μl、10×PCR緩沖液2μl和 dNTPs 0.3μl（2.5mmol/ L），加去離子水至15μl，先94℃預(yù)變性2min，再94℃變性20s，62℃退火20s，72℃延伸40s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后72℃3min。以上PCR產(chǎn)物2μl，10×Taq DNA連接酶緩沖液1μl，Taq DNA連接酶（40U/μl）0.125μl，每條探針（10bp）0.01μl，加去離子水至10μl。先94℃30s，再60℃3min，共進(jìn)行20個(gè)循環(huán)。取1μl連接產(chǎn)物，加2μl上樣Loading Dye 95變性3min，立即冰水浴，測(cè)序儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司ABI 377型）檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)過程和基因型分析在上海捷瑞生物工程有限公司實(shí)驗(yàn)室實(shí)施。上下游引物、探針和產(chǎn)物大小見表1。

表1 引物、探針序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.2.3 測(cè)序 為驗(yàn)證檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，每1個(gè)位點(diǎn)均從所有樣本中按隨機(jī)數(shù)表法抽取5%的樣本進(jìn)行測(cè)序（委托生物芯片上海國(guó)家工程研究中心實(shí)驗(yàn)室實(shí)施）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SHEsis軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)，確定對(duì)照組是否可以代表浙江地區(qū)漢族群體。采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，并采用logistic回歸計(jì)算各位點(diǎn)的OR評(píng)估相對(duì)危險(xiǎn)度，計(jì)算95%CI。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡吻合度 對(duì)照組在g.-964 T＞C，g.2905T＞G和g.4730T＞C 3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，表明所收集的樣本可以代表群體。

2.2 兩組基因型頻率、等位基因頻率分析 IL-27p28基因檢測(cè)結(jié)果顯示，g.-964位點(diǎn)出現(xiàn)TT純合、TC雜合和CC純合，g.2905位點(diǎn)出現(xiàn)TT純合和TG雜合，g. 4730位點(diǎn)出現(xiàn)TT純合、TC雜合和CC純合，兩組g.-964位點(diǎn)的基因頻率及等位基因頻率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示該位點(diǎn)的多態(tài)性可能與浙江地區(qū)漢族人群CD易感性有關(guān)；而g.2905和g.4730位點(diǎn)的基因頻率及等位基因頻率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示該位點(diǎn)的多態(tài)性與浙江地區(qū)漢族人群CD易感性無(wú)關(guān)，詳見表2。

3 討論

目前認(rèn)為，腸道黏膜免疫應(yīng)答異常在炎癥性腸病發(fā)病及病情加重過程中起重要作用，其中Th1/Th2細(xì)胞亞群之間的平衡失調(diào)是腸道黏膜免疫應(yīng)答異常的關(guān)鍵因素。IL-27是新近發(fā)現(xiàn)的一種異源二聚體細(xì)胞因子,由特異的亞單位IL-27p28和EBI3組成[5]，與其受體結(jié)合后，通過激活JAK/STATs通路途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，引起特異的生物學(xué)反應(yīng)[6]。IL-27在免疫反應(yīng)過程中具有促炎和抗炎癥反應(yīng)的雙重免疫調(diào)節(jié)作用。在T細(xì)胞增殖分化早期，IL-27通過STAT1、STAT3途徑促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞，同時(shí)可協(xié)同IL-12促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞，及促進(jìn)初始T細(xì)胞、NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ[7]；IL-27還可通過上調(diào)初始CD4+T細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)，介導(dǎo)ICAM-1/LFA-1信號(hào)途徑來促進(jìn)Th1細(xì)胞分化[8]。Villarino等[9]在IL-27R-/-小鼠模型的研究證實(shí)了IL-27R缺乏可以降低結(jié)腸炎的發(fā)病率。這些研究充分證明了IL-27在CD的炎癥進(jìn)展過程中發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用，IL-27可能是CD易感性研究的一個(gè)重要的候選基因。

表2 兩組基因型頻率、等位基因頻率分析[例（%）]

本研究中IL-27位點(diǎn)基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，說明選擇樣本具有群體代表性。本研究結(jié)果顯示，兩組IL-27啟動(dòng)子區(qū)g.-964 T＞C的基因型頻率及等位基因頻率分布的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示該位點(diǎn)的多態(tài)性可能與浙江地區(qū)漢族人群CD易感性相關(guān),這與Li等[3]的韓國(guó)IBD人群易感性研究結(jié)果相同。同時(shí)，雖然本研究中g(shù).2905T＞G和g.4730T＞C 2個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性與浙江地區(qū)漢族人群CD易感性未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)性，其原因可能有種族差異、樣本數(shù)量不足等不確定因素，不排除這2個(gè)位點(diǎn)與其他人群CD具有相關(guān)性，也不排除IL-27基因其他位點(diǎn)與CD的發(fā)生具有相關(guān)性。

由于本研究病例數(shù)及地域較局限，故仍需行多中心大樣本的隊(duì)列研究，才能最終明確該基因多態(tài)性與中國(guó)漢族IBD發(fā)病的相關(guān)性，為進(jìn)一步篩選中國(guó)人IBD的易感基因以及未來發(fā)展基因診斷和治療提供依據(jù)。

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Association of IL-27p28 gene polymorphisms with Crohn's disease in Han population of Zhejiang province

Objective To investigate the association of IL-27p28 gene polymorphisms with Crohn's disease in Han population of Zhejiang province．Methods 75 patients with Crohn's disease and 80 healthy subjects from Han population of Zhejiang province were enrolled in the study.The g.-964 T＞C,g.2905T＞G and g.4730T＞C polymorphisms of IL-27p28 gene were analyzed by polymerase chain reaction-ligase detection reaction(PCR-LDR). Results The distributions of genotypes in both groups were fitted to Hardy-Weinberg equilibrium(P＞0.05)．There were significant differences in genotype and allele frequencies at g.－964T＞C site between patients and controls(P＜0.05),while those at g.2905 and g.4730 sites showed no significant differences between two groups(P＞0.05).Conclusion The polymorphism of IL-27p28 gene at-964T＞C site might be associated with the susceptibility to Crohn's disease in Han population of Zhejiang province,such association is not observed in sites 2905T＞G or 4730T＞C.

IL-27p28 Polymorphism Crohn's disease

2012-12-03）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

310003 杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科（王立英、陳春曉，王立英現(xiàn)在在上虞市人民醫(yī)院工作）；上虞市人民醫(yī)院消化內(nèi)科（朱新建、項(xiàng)利娟）

陳春曉，E-mail:CHCHXOK@126.com