郭慧琴　李晶　任衛(wèi)波　陳立波　劉雅學(xué)　趙海霞

摘要：為了揭示太空誘變對苜蓿耐鹽能力的影響，以搭載種子、未搭載苜蓿種子及耐鹽品種中苜1號為材料，研究了鹽脅迫下苜蓿種子發(fā)芽及其再生能力的變化。結(jié)果表明，太空誘變后，苜蓿耐鹽性與未搭載和中苜1號相比顯著增強(qiáng)，250 mmol/L NaCl脅迫下種子發(fā)芽率比未搭載增加25.7%，發(fā)芽時間縮短，子葉畸變率低。同時，搭載后的種子組培再生能力顯著增強(qiáng)，表現(xiàn)為愈傷誘導(dǎo)、胚狀體誘導(dǎo)、不定芽形成及根分化的數(shù)量和質(zhì)量顯著高于未搭載對照及中苜1號。通過鹽脅迫條件下篩選，最終獲得3株耐鹽變異材料。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；誘變；空間搭載；耐鹽；離體再生

中圖分類號：S 541.035 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：10095500（2013）01002504

太空誘變是利用近地空間環(huán)境中重粒子輻射＼[1-3＼]、微重力＼[4-6＼]、弱磁場＼[4＼]等因素，對搭載植物材料進(jìn)行誘變，從而通過篩選獲得有益變異材料＼[7＼]。紫花苜蓿（Medicago sativa）是重要的多年生豆科牧草，因具有高蛋白、富含維生素、適口性好等優(yōu)點，被廣泛種植。開展苜蓿種子太空誘變效應(yīng)研究，對于篩選優(yōu)異變異材料，加快新品種選育具有重要意義。

已有的研究表明，紫花苜蓿種子經(jīng)過太空誘變后，染色體、細(xì)胞核畸變率顯著提高＼[8＼]，誘變效應(yīng)顯著。進(jìn)一步分析表明，搭載后苜蓿的株高、初級分枝數(shù)、定植當(dāng)年的單株生物量、葉數(shù)等重要的經(jīng)濟(jì)性狀均可發(fā)生顯著變化，通過篩選，有望獲得優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的變異材料＼[9-11＼]。此外還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過太空誘變后，苜蓿葉片厚度、柵欄組織厚度均大于對照，這可能影響其抗逆性＼[11＼]。然而，有關(guān)太空誘變對苜蓿耐鹽能力影響的研究相對較少。通過研究250 mmol/L NaCl脅迫下苜蓿種子發(fā)芽能力及組培再生能力的變化，揭示太空誘變對苜蓿芽期耐鹽能力的影響，為獲得耐鹽變異材料提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試苜蓿品系種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原所提供，隨機(jī)分為2份，1份作為地面未搭載對照（ck），另1份用于太空搭載。搭載種子封入布袋，搭載于我國發(fā)射“實踐八號”育種衛(wèi)星（2006.9.92006.9.24）進(jìn)行太空誘變處理。對照品種中苜1號（Medicago sativa cv.Zhongmu No.1）種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所惠贈。

1.2 試驗方法

1.2.1 鹽脅迫濃度優(yōu)化 供試種子消毒（75%酒精浸1 min+30% H2O2浸泡30 min）后，用無菌水沖洗干凈，接種于無菌苗培養(yǎng)基（MS+7.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖）進(jìn)行發(fā)芽試驗。鹽濃度設(shè)置5個水平：0、50、100、150和250 mmol/L。每個水平設(shè)4個重復(fù)，每個重復(fù)50粒種子。培養(yǎng)條件，25 ℃，光照強(qiáng)度2 500 lx，光暗周期16 h/8 h。1周后開始統(tǒng)計正常種苗數(shù)、不正常種苗數(shù)、死種子數(shù)，并計算種子發(fā)芽率。

發(fā)芽率=正常種苗數(shù)/供試種子數(shù)×100

子葉畸變率=畸變子葉種苗數(shù)/供試種苗數(shù)×100

1.2.2 耐鹽植株再生 在250 mmol/L NaCl脅迫下，選取生長健康的無菌苗，切取子葉、下胚軸進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基SH+2，4D（3.0 mg/L）+6BA（0.5 mg/L）+7.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖+250 mmol/L NaCl。獲得愈傷組織經(jīng)胚狀體誘導(dǎo)，培養(yǎng)基為＼[SH+2，4D（3.0 mg/L）+6BA（0.5 mg/L）+水解酪蛋白10 g/L+7.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖+250 mmol/L NaCl＼]、分化（MS+7.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖+250 mmol/L NaCl）和生根（1/2 MS+7.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖）培養(yǎng)，最終獲得再生植株。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NaCl脅迫對紫花苜蓿發(fā)芽的影響

當(dāng)NaCl濃度0～150 mmol/L時，隨著濃度的增加，苜蓿種子發(fā)芽率略微降低，差異不顯著（圖1）。當(dāng)濃度為250 mmol/L時，苜蓿種子發(fā)芽率比正常水平（0 mmol/L NaCl）降低26%，差異極顯著（P<0.01）（圖1）。此外，在250 mmol/L NaCl脅迫下，苜蓿種子發(fā)芽時間從7～10 d延長至31～33 d，發(fā)芽時間延長了近3倍，多數(shù)種苗出現(xiàn)生長緩慢、子葉發(fā)白、畸變率高。因此，選定250 mmol/L NaCl作為篩選耐鹽突變體的鹽濃度。

2.2 太空誘變對紫花苜蓿耐鹽發(fā)芽能力的影響

無鹽脅迫，中苜1號、地面對照及搭載種子發(fā)芽率達(dá)到98%以上，三者間無顯著差異，此外種苗生長健康，無明顯畸變。在250 mmol/L NaCl脅迫下，中苜1號和地面未搭載對照種子發(fā)芽率顯著降低，發(fā)芽天數(shù)由原來的7 d增加到20 d。與未搭載對照和中苜1號相比，太空誘變種子發(fā)芽率分別比未搭載對照和中苜1號高25%和27%，差異極顯著（P<0.01）（表1）。此外，搭載后苜蓿種苗生長健康，多數(shù)種苗無失綠、畸變等現(xiàn)象。

2.3 太空誘變對紫花苜蓿NaCl脅迫下組織培養(yǎng)再生能力的影響

在250 mmol/L NaCl脅迫下，與未搭載對照相比，太空誘變組培再生能力顯著增強(qiáng)，主要表現(xiàn)為子葉愈傷誘導(dǎo)率、子葉胚狀體誘導(dǎo)數(shù)、胚軸愈傷誘導(dǎo)率、胚軸胚狀體數(shù)顯著提高（P<0.05）（圖2）。中苜1號與未搭載對照間無顯著差異。

在高鹽脅迫下，地面未搭載對照外植體會在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)變白而凋亡，多數(shù)無法形成正常愈傷；即使少量可以形成愈傷，但愈傷組織顏色較淺，結(jié)構(gòu)松散，不利于不定芽的形成及根分化（圖3）。

與對照相比，搭載后種子組織再生能力顯著增強(qiáng)，可形成高質(zhì)量的愈傷組織，主要表現(xiàn)為愈傷組織顏色深綠，結(jié)構(gòu)緊湊，且其表面容易形成較大的不定芽，通過分化，可獲得完整植株。最終通過多次篩選，獲得3株耐鹽變異植株。

3 討論與結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)太空誘變后，苜蓿種子耐鹽發(fā)芽能力顯著提高，表現(xiàn)為種子發(fā)芽速度快，發(fā)芽率顯著提高。這與已有的研究結(jié)果基本一致。杜志釗等＼[12＼]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過太空搭載后，在0.5% NaCl脅迫下，飛行組大麥種子的發(fā)芽率比對照高34%；在1.0% NaCl脅迫下，飛行組種子發(fā)芽率比對照高40%，表明太空誘變可顯著提高大麥種子芽期耐鹽能力。陸瑞菊等＼[13＼]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過空間搭載后，大麥種子鹽脅迫發(fā)芽能力顯著提高，表現(xiàn)為250 mmol/L NaCl脅迫下，大部分飛行材料主根長度、發(fā)根數(shù)、發(fā)芽率等顯著提高。

注：1～3分別為未搭載對照下胚軸誘導(dǎo)愈傷組織、不定芽和再生苗；4～6分別為太空誘變材料誘導(dǎo)愈傷組織、不定芽和再生苗

太空誘變與組織培養(yǎng)相結(jié)合是篩選抗逆脅迫變異品系的有效途徑之一＼[17＼]。苜蓿的組培再生能力受基因型、外植體類型、激素配比等因素影響＼[14-16＼]。研究發(fā)現(xiàn)，太空誘變對苜蓿鹽脅迫下組培再生能力有顯著影響，表現(xiàn)為愈傷組織、不定芽形成速度與質(zhì)量顯著提高。這與搭載后苜蓿耐鹽能力增強(qiáng)有關(guān)。這與已有的研究結(jié)果基本一致。亞麻種子經(jīng)過太空誘變后，其后代抗NaCl、PEG能力增強(qiáng)，通過組培得到抗1.2 % NaCl的變異系。當(dāng)NaCl濃度在0.9%時，變異系相對生長量（脅迫條件下實際生長量/無脅迫條件下生長量）保持70%，而此時對照只要10%。對照系在鹽濃度大于1.2%時生長完全被抑制，變異系明顯表現(xiàn)出對鹽抗性＼[18＼]。

參考文獻(xiàn)：

＼[1＼] De Micco，Arena C，Diana P，et al.Effects of sparsely and densely ionizing radiation on plants＼[J＼].2011，50（1）：1-19.

＼[2＼] Wu Y，Yang D Y，Tu P F.Genetic differentiation induced by spaceflight treatment of Cistanche deserticola and identification of intersimple sequence repeat markers associated with its medical constituent contents＼[J＼].Advances in Space Research，2011，47（4）：591-599.

＼[3＼] Rios A D L，AScaso C，Wierzchos J，et al.Space flight effect on Lichen ultrastructure and physiology following the LICHENS 2005 experiment onboard the BIOPAN V space exposure facility＼[J＼].Symbioses and Stress，2010，17（5）：577-593.

＼[4＼] Gao H，Liu Z H，Zhang L X.Secondary metabolism in simulated microgravity and space flight＼[J＼].Protein and cell，2011，2（11）：858-861.

＼[5＼] 陳志梅，張宗舟，薛林貴，等.航天誘變混菌生抽發(fā)酵研究＼[J＼].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，46（3）：104-108.

＼[6＼] Matia I，F(xiàn)emando G C，Herranz R，et al.Plant cell proliferation and growth are altered by microgravity conditions in space flight＼[J＼].Journal of plant physiology，2010，167（3）：184-193.

＼[7＼] 胡化廣，劉建秀，郭海林.我國植物空間誘變育種及其在草類植物育種中的應(yīng)用＼[J＼].草業(yè)學(xué)報，2006，15（1）：15-21.

＼[8＼] 任衛(wèi)波，徐柱，陳立波，等.紫花苜蓿種子衛(wèi)星搭載后其根尖細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)＼[J＼].核農(nóng)學(xué)報，2008，22（5）：566-568.

＼[9＼] 王蜜，魏建民，郭慧琴，等.紫花苜蓿空間誘變突變體篩選及其RAPD多態(tài)性分析＼[J＼].草地學(xué)報，2009，17（6）：841-844.

＼[10＼] 范潤鈞，鄧波，陳本建，等.航天誘變紫花苜蓿第一代植株表型變異及基因多態(tài)性分析＼[J＼].草地學(xué)報，2011，19（5）：795-802.

＼[11＼] 張文娟，鄧波，張?zhí)N薇，等.空間飛行對不同紫花苜蓿品種葉片顯微結(jié)構(gòu)的影響＼[J＼].草地學(xué)報，2010，18（2）：233-236.

＼[12＼] 杜志釗，陳銀華，周永康，等.空間誘變大麥的耐鹽性篩選及大田鑒定＼[J＼].中國農(nóng)業(yè)通報，2009，25（23）：105-107.

＼[13＼] 陸瑞菊，杜志釗，陳志偉，等.大麥空間誘變SP2和SP3代萌發(fā)期耐鹽性變異＼[J＼].核農(nóng)學(xué)報，2010，35（5）：901-909.

＼[14＼] 王娟，師尚禮.不同苜蓿品種再生體系的差異性比較＼[J＼].草原與草坪，2010（3）：66-69.

＼[15＼] 王珺，柳小妮.植物激素對2個紫花苜蓿品種再生體系的影響＼[J＼].草原與草坪，2010（6）：15-18.

＼[16＼] 徐春波，王勇，趙海霞，等.紫花苜蓿高頻組培再生體系影響因素研究＼[J＼].草原與草坪，2010（4）：55-58

＼[17＼] 曹樺，楊軍.衛(wèi)星搭載胡蘿卜組織培養(yǎng)研究＼[J＼].西華師范大學(xué)學(xué)報，2006（1）：53-56.

＼[18＼] 徐云遠(yuǎn)，賈敬芬，牛炳韜.衛(wèi)星搭載亞麻后代中PEG和NaCl抗性系的初步篩選＼[J＼].西北植物學(xué)報，2000，20（2）：159-163.