安彩華

【摘 要】米曲霉菌種蛋白酶活力對醬油發(fā)酵階段出油至關(guān)重要，成曲的酶活力強，有利于提高原料的利用率，促進制曲和發(fā)酵階段的分解作用。但在生產(chǎn)中三角瓶種中性蛋白酶活力不穩(wěn)定，給生產(chǎn)原料利用率帶來了損失。本實驗從三個方面研究對中性蛋白酶活力的影響。

【關(guān)鍵詞】米曲霉；中性蛋白酶活力；斜面菌種；三角瓶菌種；孢子數(shù)

0.引言

醬油是原料經(jīng)蒸熟冷卻，接入純粹培養(yǎng)的米曲霉菌種制成醬曲，醬曲移入發(fā)酵池，加鹽水發(fā)酵，待醬醅成熟后，以浸出法提取醬油。制曲的目的是使米曲霉在曲料上充分生長發(fā)育，并大量產(chǎn)生和積蓄所需要的酶，如蛋白酶、肽酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶、果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等。在發(fā)酵過程中味的形成是利用這些酶的作用。如蛋白酶及肽酶將蛋白質(zhì)水解為氨基酸，產(chǎn)生鮮味；谷氨酰胺酶把無味的谷氨酰胺變成具有鮮味的俗谷氨酸；淀粉酶將淀份水解成糖，產(chǎn)生甜味；果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶等能將細胞壁完全破裂，使蛋白酶和淀粉酶水解等更徹底[1]。本實驗的目的就是在三角瓶階段獲得大量的純菌種，菌絲發(fā)育健壯，產(chǎn)酶能力強、孢子數(shù)量多、孢子的耐久性強、發(fā)芽率高，為種曲提供優(yōu)良的種子。

1.實驗材料與方法

1.1實驗材料、儀器、培養(yǎng)條件

1.1.1 實驗材料

斜面菌種、麥糠、米粕、小麥面粉、500ml三角瓶、孢子數(shù)。

1.1.2實驗儀器

電子分析天平（0.1mg）（A&D;）；721分光光度計（河南兄弟儀器設備有限公司）；水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療器械）；微量可調(diào)移液槍（Finnpiptte）；血球計數(shù)板（上海醫(yī)樂醫(yī)用光學儀器廠）

1.1.3培養(yǎng)條件

接完種后，在培養(yǎng)室28-300C培養(yǎng)，72小時成曲。

1.2實驗方法

1.2.1實驗設計

本實驗采用四種實驗方案：

（1）不同斜面菌種實驗：用不同的煮豆方法煮出的豆汁配制斜面進行斜面接種，待斜面成熟后進行感官檢驗和發(fā)芽率實驗，剔除不合格斜面。然后用合格斜面接種三角瓶，放在培養(yǎng)室28-30°C培養(yǎng)。做成曲的的孢子數(shù)和蛋白酶活力的測定。

（2）三角瓶種配方實驗：麥糠、米粕、面粉按照一定比例配制，加總量的93%的水，待放置30分鐘過后進行攪拌分料，滅菌接種培養(yǎng)28-30°C，72小時成曲。測成曲的孢子數(shù)和中性蛋白酶活力。

（3）三角瓶種量實驗：用基礎(chǔ)配方麥糠：米粕：面粉=75：17：8，加水量93%，不同接種量，培養(yǎng)28-30°C，72小時成曲。測成曲的孢子數(shù)和中性蛋白酶活力。

1.2.2中性蛋白酶活力測定方法

取試管兩只，每只試管加入樣品稀釋液1ml，置于40度水浴中預熱2min，再各加入經(jīng)同樣預熱的酪蛋白5ml，精確保溫10min。時間到后，各管立即加入0.4mol/L三氯醋酸5ml，以終止反應。繼續(xù)水浴中保溫20min，使殘余蛋白質(zhì)沉淀后離心分離或過濾。取濾液用751分光光度計在275nm處測定其吸收度。

空白實驗2測定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4mol/L三氯醋酸5ml，使酶失活，在加酪蛋白。

計算：在40度下每1min水解酪蛋白產(chǎn)生1Ug酪氨酸，定義為一個蛋白酶活力單位。

蛋白酶活力單位=ΔA/10× 11×K×N

K：常數(shù)，吸光度為1時蛋白酶活力單位，由酪氨酸標準曲線得出；

N：為稀釋倍數(shù)。

1.2.3孢子數(shù)的測定[2]

取潔凈干燥的血球計數(shù)板蓋上蓋玻片，用無菌滴管取孢子稀釋液1小滴滴于蓋玻片的邊緣處（不宜過多），讓滴液自行滲入計數(shù)室中，注意不可有氣泡產(chǎn)生。若有多余液滴，可用吸水紙吸干，靜止5min，待孢子沉降。 用高倍鏡頭觀察四個角上的4個中格（即100個小格）的孢子數(shù)。

16×25的計數(shù)板

孢子數(shù)（個/g）=（N/100） ×400×10000×（V/G）=4×104×（NV/G）…… （1）

式中N—100小格內(nèi)孢子總數(shù)（個）；

V—孢子稀釋液體積（ml）；

G—樣品重量（g）。

2.結(jié)果與討論

2.1不同斜面菌種對三角瓶種中性蛋白酶活力的影響

表一

備注：斜面I3和J為舊的煮豆方法，斜面I1 和J1為新的煮豆方法；I1和I3、J1和J3為同一個斜面。

結(jié)論：從以上數(shù)據(jù)可以看出，煮豆方法的改變所配制的斜面菌種對三角瓶種成曲中性蛋白酶活力影響不大；孢子數(shù)多的菌種蛋白酶活力高。

2.2 不同培養(yǎng)基配方對三角瓶種中性蛋白酶活力的影響

表二

（備注：第一次實驗所用斜面批號為A060217-2G；第二、三次實驗所用斜面批號均為A060223-I1和A060223-I3。配方一、配方五與配方六生長較快。）

結(jié)論：合適的碳氮比可以提高三角瓶種中性蛋白酶活力，孢子數(shù)多的斜面其三角瓶成曲中性蛋白酶活力高；再次證明孢子數(shù)多的菌種蛋白酶活力高。

2.3不同接種量對三角瓶種中性蛋白酶活力的影響

表三

（備注：本次實驗所用斜面批號為A060227-2K。）

結(jié)論：從以上實驗可以看出，合適的接種量可以提高菌種的蛋白酶活力。接種量太少，菌種生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)充足，容易出現(xiàn)氣生菌絲；接種量太大，菌種生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)不夠，對菌種的生長造成影響，蛋白酶活力低。

3.結(jié)論

實驗結(jié)果表明：

（1）不同的煮豆方法配制的斜面對三角瓶種中性蛋白酶活力影響不大。制作斜面用的培養(yǎng)基主要是豆汁，添加一些微量元素。從實驗中可以看出，煮豆方法的改變并沒有改變豆汁中營養(yǎng)素的改變和一些糖類的改變。

（2）培養(yǎng)基配方的改變對三角瓶種中性蛋白酶活力影響較大。我們添加米粕、麥糠主要目的是提供菌種生長所需的碳源和氮源和微量元素、無機鹽。氨基酸等。而且麥糠質(zhì)地疏松，表面積大，營養(yǎng)成分適于促進米曲霉的生長和產(chǎn)酶。

（3）適當?shù)慕臃N量可以提高成曲蛋白酶活力。接種量太大，生長所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，導致成曲色澤不均，孢子數(shù)較少，包子發(fā)芽率低；接種量低，菌種生長營養(yǎng)物質(zhì)過于旺盛，再生菌絲過多，成曲長白毛結(jié)塊嚴重，造成成曲孢子數(shù)、發(fā)芽率、蛋白酶活力低。我們在生產(chǎn)中要嚴格把控三角瓶中的質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)成曲質(zhì)量低要嚴格去掉，不能用于生產(chǎn)。

（4）孢子數(shù)影響蛋白酶活力。孢子數(shù)多的成曲蛋白酶活力相應增高。

（5）從表二和表三種可以看出，適當提高培養(yǎng)基的加水量，可以提高成曲蛋白酶活力。水分適當，不僅對包子發(fā)芽有利，而且為以后產(chǎn)酶多、酶活性強創(chuàng)造了條件。

【參考文獻】

[1]董勝利，徐開生.釀造調(diào)味品生產(chǎn)技術(shù).2003.

[2]天津輕工業(yè)學院，大連輕工業(yè)學院，無錫輕工業(yè)學院，華南工學院匯編.食品發(fā)酵分析.1980.

[3]天津輕工業(yè)學院，無錫輕工業(yè)大學合編.食品微生物學.1980.