袁濤 楊偉俊 薛文采 程波
復(fù)方刺山柑膠囊是新疆藥物研究所自主研發(fā)的復(fù)方藥物,由刺山柑、川西獐牙菜、波棱瓜子、大黃、苦荬菜、木香、兔耳草、唐古特烏頭、角茴香、甘草、金錢草、訶子、黃芪等多味藥材組成,具有清熱解毒,疏肝利膽、利濕退黃之功能,用于急性黃疸型肝炎、急性膽囊炎屬肝膽溫?zé)嶙C者。根據(jù)處方各藥味理化性質(zhì)結(jié)合本方功效,課題組前期以蒽醌類等有效成分為指標(biāo),對(duì)處方中刺山柑等藥味進(jìn)行了乙醇提取工藝研究[1]。本文繼以甘草酸銨含量、沒食子酸含量、浸膏得率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo),采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)和L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)處方中甘草、黃芪、金錢草、訶子的水提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,為該制劑的制備工藝提供支持。
甘草酸銨、沒食子酸對(duì)照品(均由中國藥品生物制品檢定所提供,批號(hào)依次為110731-200614、110818-200404);訶子等藥材購自安徽亳州中藥材公司,經(jīng)檢驗(yàn)符合相應(yīng)的藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。甲醇為美國Fisher 公司產(chǎn)色譜純,醋酸銨、冰醋酸等試劑均為分析純。
SPD-10AVP 型高效液相色譜儀(日本島津制造所),包括LC-10ATVP 二元高壓泵,SPD-10AVP 紫外檢測(cè)器,CTO-10ASVP 柱溫箱,SCL-10AVP 系統(tǒng)控制器;LibrorAEG-200 電子天平(日本島津制造所);Millipore simplicity-185 超純水器(美國密理博公司);LS-3120 超聲波發(fā)生器(美國科學(xué)系統(tǒng)公司)。
2.1.1 色譜條件 Diamonsil 柱(250×4.6 mm,5 μm);甲醇-0.2 mol·L-1醋酸銨-冰醋酸(67:33:1)為流動(dòng)相;柱溫:30 ℃;檢測(cè)波長為250 nm;流速1 ml·min-1。理論板數(shù)按甘草酸峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。
2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取甘草酸銨對(duì)照品適量,加甲醇制成每1 ml 含0.176 mg 的溶液(折合甘草酸為0.1724 mg),搖勻,即得。
2.1.3 供試品溶液的制備 取水煎液,濾過(0.45 μm 微孔濾膜),取續(xù)濾液1 ml,置5 ml 量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。
2.2.1 色譜條件 Diamonsil 柱(250×4.6 mm,5 μm);甲醇-0.05%磷酸(5:95)為流動(dòng)相;柱溫:30 ℃;檢測(cè)波長為273 nm。流速1 ml·min-1;理論板數(shù)按沒食子酸峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。
2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的沒食子酸對(duì)照品適量,加甲醇制成每1 ml 含10.4 μg 的溶液,即得。
2.2.3 供試品溶液的制備 取水煎液,濾過(0.45 μm 微孔濾膜),取續(xù)濾液1 ml,置5 ml 量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。
精密吸取提取液50 ml,置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中,水浴蒸干,105 ℃干燥至恒重,取出,迅速置干燥器中冷卻,稱重,按下式計(jì)算。浸膏得率=干浸膏重量/藥材重量×100%。
各因素評(píng)分計(jì)算方法:甘草酸銨評(píng)分=(甘草酸銨含量/最大甘草酸銨含量)×40%;沒食子酸評(píng)分=(沒食子酸含量/最大沒食子酸含量)×40%;浸膏得率評(píng)分=(浸膏得率/最大浸膏得率)×20%
綜合評(píng)分計(jì)算方法:綜合評(píng)分=甘草酸銨評(píng)分+沒食子酸評(píng)分+浸膏得率評(píng)分
2.5.1 加水量考察 按處方比例稱取甘草、金錢草(酌余斷碎)、訶子、黃芪,分別加6 倍、8 倍、10 倍、12 倍量水,提取2 次,每次2 小時(shí),測(cè)定甘草酸銨含量、沒食子酸含量和水浸出物量,并計(jì)算綜合評(píng)分。溶劑量對(duì)甘草酸銨的提取率影響較大,隨著溶劑量的增加,提取率呈上升趨勢(shì),當(dāng)溶劑量在10 倍量以上時(shí),影響趨于穩(wěn)定;當(dāng)溶劑量在藥材量的8 倍以上時(shí),對(duì)浸膏得率的影響不大;另外,隨著溶劑量的增加,沒食子酸的提取率呈現(xiàn)先增加后穩(wěn)定并略微下降的趨勢(shì),總體趨于平衡。就綜合評(píng)分看,在10 倍量溶劑時(shí)綜合評(píng)分最高,綜合考慮各因素的相互影響,確定采用8 ~12 倍量溶劑進(jìn)一步進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),優(yōu)化提取工藝。見表1。
2.5.2 提取時(shí)間考察 按處方比例稱取甘草,金錢草(酌余斷碎),訶子,黃芪,加8 倍量水,提取2 次,分別提取不同時(shí)間,測(cè)定甘草酸銨含量、沒食子酸含量和水浸出物量,并計(jì)算綜合評(píng)分。提取時(shí)間對(duì)沒食子酸的提取率影響較大,隨著溶劑量的增加,提取率呈上升趨勢(shì),當(dāng)提取時(shí)間在1.5 小時(shí)以上時(shí),影響趨于穩(wěn)定;提取時(shí)間在1.0 小時(shí)以上時(shí),對(duì)浸膏得率的影響不大;另外,隨著溶劑量的增加,甘草酸銨的提取率呈現(xiàn)先增加后穩(wěn)定并略微下降的趨勢(shì),可能是復(fù)方中發(fā)生成分相互作用,其機(jī)理有待于進(jìn)一步闡明。就綜合評(píng)分看,在提取時(shí)間達(dá)1.5 小時(shí)時(shí)綜合評(píng)分最高,綜合考慮各因素的相互影響,確定采用1.0 ~2.0 小時(shí)進(jìn)一步進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),優(yōu)化提取工藝。見表2。
2.5.3 提取次數(shù)考察 按處方比例稱取甘草,金錢草(酌余斷碎),訶子,黃芪,總共加20 倍量水,分別提取不同次數(shù),總共提取2 小時(shí),測(cè)定甘草酸銨含量、沒食子酸含量和水浸出物量,并計(jì)算綜合評(píng)分。提取次數(shù)對(duì)沒食子酸的提取率影響較大,隨著提取次數(shù)的增加,提取率呈上升趨勢(shì),當(dāng)提取次數(shù)在2 次以上時(shí),影響趨于穩(wěn)定;提取次數(shù)對(duì)浸膏得率和甘草酸銨的影響不顯著。就綜合評(píng)分看,綜合平分隨提取次數(shù)的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì),考慮大生產(chǎn)的可操作性和控制成本,綜合考慮各因素的相互影響,確定采用1 ~3 次進(jìn)一步進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),優(yōu)化提取工藝。見表3。
表1 加水量對(duì)甘草酸銨、沒食子酸含量和浸膏得率的影響
表2 提取時(shí)間對(duì)甘草酸銨、沒食子酸含量和浸膏得率的影響
表3 提取次數(shù)對(duì)甘草酸銨、沒食子酸含量和浸膏得率的影響
2.6.1 因素水平安排 在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,考察提取次數(shù)(A)、提取時(shí)間(B)、加水量(C)三個(gè)因素對(duì)甘草酸銨含量、沒食子酸含量及浸膏得率的影響。按L9(34)正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn),見表4。
表4 L9(34)正交試驗(yàn)的因素水平表
2.6.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5,方差分析見表6。
從直觀分析知,各因素對(duì)綜合評(píng)分的影響大小順序?yàn)?A(提取次數(shù))>B(提取時(shí)間)>C(加水量);每個(gè)因素三個(gè)水平之間的趨勢(shì)為A3>A2>A1,B3>B1>B2,C2>C1>C3,直觀分析得提取工藝為A3B3C2,即加10 倍量水煎煮3 次,每次2 小時(shí)。方差分析結(jié)果表明:A 因素的影響具有顯著性(P <0.05),B 和C 因素的影響均不顯著(P >0.05),結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果,從大工業(yè)生產(chǎn)和節(jié)能降耗等綜合考慮,以A3B1C1組合為佳。由于優(yōu)選的工藝未包括在正交設(shè)計(jì)表的9 次試驗(yàn)中,故對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表7。
表5 L9(34)正交試驗(yàn)安排及結(jié)果
表6 L9(34)正交試驗(yàn)的方差分析結(jié)果
三次驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明,所測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)均高于正交試驗(yàn)的結(jié)果。說明篩選的工藝可行。故最終優(yōu)化的水提工藝為:甘草、金錢草、訶子、黃芪四味,加水8 倍量提取3 次,每次1 小時(shí)。
表7 L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)選工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果
本文采用水為溶劑復(fù)方共煎,主要兼顧了處方各藥味所含化學(xué)成分的理化性質(zhì)及其與功能主治的相關(guān)性。甘草中主要有效成分為甘草酸,而其α體甘草酸二銨具有治療慢性乙型肝炎作用[5],對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721 具有明顯細(xì)胞毒性和抑制增殖作用[6];訶子中總酚類化合物對(duì)抗氧化活性呈良好的線性相關(guān)[7];黃芪中黃芪甲苷及黃芪多糖可抑制人肝癌細(xì)胞株的增殖,誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[8]。金錢草水提取液具有清熱解毒、利尿排石、活血散淤之功效,用于肝、膽結(jié)石、膽囊炎、黃疸性肝炎。根據(jù)上述四味藥所含有效成分的理化性質(zhì)及其藥理學(xué)特點(diǎn),確定采用水提取,結(jié)合其臨床曾以湯劑復(fù)方煎煮的用藥習(xí)慣,本文選擇復(fù)方共煎。
中藥復(fù)方的化學(xué)成非常復(fù)雜,采用單個(gè)指標(biāo)成分或活性成分難易全面反映提取工藝的優(yōu)劣,本文對(duì)藥效明確的藥味采用化學(xué)成分,如甘草中的甘草酸銨和訶子中的沒食子酸為考察指標(biāo)。但此兩種成分并不能夠完全代表有效成分,所以同時(shí)結(jié)合復(fù)方藥物的特點(diǎn),采用浸膏得率為考察指標(biāo),兼顧了現(xiàn)代研究和傳統(tǒng)復(fù)方的優(yōu)勢(shì),并根據(jù)相對(duì)貢獻(xiàn)值分配權(quán)重。通過上述考察指標(biāo),使工藝考察緊扣處方功能主治,保證了臨床有效性。
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