李瓊，王海波，蔡興奎，雷婷，柳俊

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家蔬菜改良中心華中分中心，湖北武漢430070）

遺傳育種

馬鈴薯抗青枯病和低溫糖化體細(xì)胞雜種的鑒定

李瓊，王海波，蔡興奎，雷婷，柳俊*

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家蔬菜改良中心華中分中心，湖北武漢430070）

ACC-1-1和ACC-1-2再生株系由來(lái)自馬鈴薯二倍體栽培種（Solanum tuberosum）品系A(chǔ)C142-01（2n= 2x=24）和二倍體野生種S.chacoense的一個(gè)無(wú)性系C9701（2n=2x=24）經(jīng)原生質(zhì)體融合獲得，經(jīng)鑒定為體細(xì)胞雜種。流式細(xì)胞儀分析和染色體計(jì)數(shù)顯示，ACC-1-1為混倍體，ACC-1-2為八倍體。兩個(gè)株系均能正常開(kāi)花但花粉活力較低?；ǚ勰讣?xì)胞減數(shù)分裂觀察顯示，兩個(gè)系在減數(shù)分裂各個(gè)時(shí)期均出現(xiàn)廣泛的異常染色體行為，可能是花粉活力低的原因。青枯病接種鑒定表明，ACC-1-2對(duì)青枯病表現(xiàn)為高抗，而ACC-1-1表現(xiàn)為中感，同時(shí)這兩個(gè)株系均具有“低溫糖化”抗性，證明體細(xì)胞融合加上適當(dāng)選擇可以有效聚合有性雜交不親和雙親的優(yōu)良性狀。

馬鈴薯；體細(xì)胞雜種；青枯病；低溫糖化

馬鈴薯原始栽培種和野生種具有眾多優(yōu)良性狀，如對(duì)各種病蟲(chóng)害的抗性、對(duì)逆境的耐性及其他重要的經(jīng)濟(jì)性狀等，是馬鈴薯巨大的種質(zhì)資源庫(kù)[1]。將這些原始栽培種和野生種的優(yōu)良性狀導(dǎo)入栽培種中愈來(lái)愈被世界各國(guó)的育種家所重視。然而，由于胚乳平衡數(shù)（Endosperm balance number，EBN）[2]及雜交不親和性等障礙，導(dǎo)致野生種和普通栽培種之間直接雜交很難成功，限制了這些野生種在雜交育種中的應(yīng)用。體細(xì)胞融合技術(shù)可以有效的克服種間雜交障礙，為野生種的利用提供了有效途徑。隨著體細(xì)胞雜交技術(shù)的不斷成熟和完善，這一技術(shù)已逐漸成為育種資源創(chuàng)制的重要途徑。利用該技術(shù)，已創(chuàng)制出大量的馬鈴薯種內(nèi)、種間、屬間甚至是科間的體細(xì)胞雜種[3-7]。

馬鈴薯抗病優(yōu)質(zhì)是新品種選育的基本要求，但目前的育種資源中同時(shí)具有抗病性和優(yōu)質(zhì)性的基因型很少，雖然利用雜交重組理論上可以將兩個(gè)性狀互補(bǔ)，但其組合頻率很低，育種幾率有限。特別是前期在進(jìn)行體細(xì)胞雜交過(guò)程中，受培養(yǎng)反應(yīng)的限制，一般栽培種親本以考慮容易培養(yǎng)的基因型為主，對(duì)其優(yōu)良性狀考慮不多，導(dǎo)致創(chuàng)制的體細(xì)胞雜種直接利用受到限制。本實(shí)驗(yàn)室前期利用抗“低溫糖化”二倍體栽培種系A(chǔ)C142-01和抗青枯病的二倍體野生種Solanum chacoence的一個(gè)無(wú)性系C9701通過(guò)原生質(zhì)體融合獲得了兩個(gè)體細(xì)胞雜種系，但它們是否同時(shí)具有青枯病抗性和抗低溫糖化能力目前還不清楚。本研究在進(jìn)一步確定其雜種特征的基礎(chǔ)上，對(duì)其抗青枯病和抗低溫糖化特性及其與育種相關(guān)的性狀進(jìn)行了鑒定，為育種利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

二倍體栽培種無(wú)性系A(chǔ)C142-01（2n=24），二倍體野生種S.chacoense的一個(gè)無(wú)性系C9701（2n= 24），原生質(zhì)體融合獲得的兩個(gè)融合子[8]ACC-1-1、ACC-1-2。

1.2 材料種植

2012年將繼代培養(yǎng)3周的再生植株及其親本試管苗移栽到網(wǎng)室花缽中（AB 380 mm）。每個(gè)株系種植8株。待收獲后的塊莖打破休眠后，繼續(xù)缽栽種植于網(wǎng)室用于性狀觀察。

1.3 融合植株的分子鑒定

利用SSR標(biāo)記和RAPD標(biāo)記鑒定兩個(gè)再生株系是否為體細(xì)胞雜種?；蚪MDNA抽提方法參見(jiàn)Ghislain等[9]的方法。SSR引物來(lái)自于CIP數(shù)據(jù)庫(kù)（http:∕∕research.cip.cgiar.org∕IPD∕SSR-primer），PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系、程序及產(chǎn)物的檢測(cè)參照Chen等[10]。

1.4 倍性檢測(cè)

雜種植株的倍性檢測(cè)采用根尖染色體壓片和流式細(xì)胞儀檢測(cè)。根尖染色體壓片參照葉文宣[11]的方法；流式細(xì)胞儀檢測(cè)參照郭鮮蒲[12]的方法。

1.5 花粉母細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)觀察

從2013年5月12日開(kāi)始，于晴天上午8∶30～10∶00采集雜種及親本不同大小的花蕾。采集后的花蕾的處理及觀察等參照郭鮮蒲[12]的方法。

1.6 花粉活力測(cè)定

在2013年5月的晴天上午取剛剛開(kāi)放的花蕾（花藥剛裂開(kāi)，花藥裂口處未變黑），采用醋酸洋紅染色的方法測(cè)定體細(xì)胞雜種及其親本的花粉活力。檢測(cè)方法參照郭鮮蒲[12]的方法。

1.7 青枯病室內(nèi)鑒定

青枯病抗性鑒定方法參見(jiàn)蔡興奎[13]的方法。菌株采用本實(shí)驗(yàn)室分離并鑒定的青枯菌生理小種1號(hào)（生化3號(hào)），以馬鈴薯栽培種‘中薯二號(hào)’孤雌生殖無(wú)性系8#作為感病對(duì)照，體細(xì)胞雜種3C28-1作為抗性對(duì)照。抗性評(píng)價(jià)參照梁遠(yuǎn)發(fā)等[14]的方法。

1.8 低溫糖化檢測(cè)

油炸薯片的加工、色澤分析及還原糖含量的測(cè)定參照歐庸彬[15]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜種鑒定

研究對(duì)兩個(gè)融合子同時(shí)采用RAPD標(biāo)記和SSR標(biāo)記進(jìn)行了鑒定。RAPD引物OPI-10（ACA ACG CGA G）在兩融合親本中可以擴(kuò)增出差異條帶，栽培種親本AC142-01的特征帶顯示在800 bp左右，野生種親本C9701的特征帶大小約為600 bp，融合子均同時(shí)顯示了互補(bǔ)的特征帶（圖1 a），說(shuō)明二者均為體細(xì)胞雜種。進(jìn)一步采用一個(gè)在兩融合親本中可以擴(kuò)增出差異條帶的SSR標(biāo)記引物STI0057對(duì)體細(xì)胞雜種進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示引物STI0057在栽培種親本AC142-01的特征片段大小約為140 bp，野生種親本C9701的特征片段大小約為160 bp，在變性膠上呈現(xiàn)大小不同的清晰帶（圖1 b）。兩個(gè)融合子同時(shí)具有雙親的特異片段，進(jìn)一步說(shuō)明再生株系是雙親融合的體細(xì)胞雜種。

2.2 體細(xì)胞雜種倍性分析

2.2.1 流式細(xì)胞儀分析

本研究首先采用流式細(xì)胞儀對(duì)兩個(gè)體細(xì)胞雜種的倍性進(jìn)行了初步鑒定。以二倍體栽培種融合親本為對(duì)照，峰值定位于50。結(jié)果顯示，ACC-1-1呈現(xiàn)出兩個(gè)明顯的主峰，峰值分別為123和211，表明其為混倍體；ACC-1-2只有一個(gè)明顯的主峰，峰值為187，按照對(duì)照峰值推算可能為八倍體（圖2）。

2.2.2 體細(xì)胞雜種的染色體計(jì)數(shù)

圖1 體細(xì)胞雜種鑒定Figure 1 Identification of somatic hybrids by RAPD and SSR markers

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)親本及體細(xì)胞雜種植株的倍性水平Figure 2 Ploidy determination of in vitro plants of fusion parents C9701 and AC142-01 and their somatic hybrids by flow cytometer

表1 體細(xì)胞雜種的染色體數(shù)Table 1 Chromosome number of somatic hybrids

進(jìn)一步對(duì)兩個(gè)親本和兩個(gè)體細(xì)胞雜種系進(jìn)行了染色體計(jì)數(shù)，每個(gè)材料至少統(tǒng)計(jì)35個(gè)細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果列于表1。染色體計(jì)數(shù)結(jié)果表明，AC142-01（圖3 a）和親本C9701（圖3 b）染色體數(shù)在22～24之間，卡方檢測(cè)證明其與二倍體（2n=2x= 24）顯著符合。雜種ACC-1-1有兩種細(xì)胞類型，一類為染色體數(shù)69～74，卡方檢測(cè)與六倍體（2n=72）顯著符合（圖3 c），另一類為染色體數(shù)94～98，卡方檢測(cè)與八倍體（2n=96）顯著符合（圖3 d）。這一結(jié)果與上述流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明該系為六倍體至八倍體的混倍體。ACC-1-2的染色體數(shù)94～98，卡方檢測(cè)表明該系為八倍體（圖3 e）。

2.3 體細(xì)胞雜種花粉母細(xì)胞(PMC)減數(shù)分裂觀察

將2012年秋季收獲的雜種及親本的塊莖催芽，于2013年2月種植在網(wǎng)室花缽中，均能夠正?，F(xiàn)蕾開(kāi)花。在現(xiàn)蕾期取親本和體細(xì)胞雜種不同大小的花蕾用于小孢子減數(shù)分裂觀察。觀察結(jié)果表明，融合雙親小孢子形成過(guò)程中，減數(shù)分裂各時(shí)期染色體行為大多正常，二分體、四分體形成正常。但體細(xì)胞雜種小孢子減數(shù)分裂過(guò)程中的染色體行為大多不正常，各個(gè)時(shí)期均能觀察到異常的染色體行為（表2）。從表2可以看出，兩個(gè)雜種小孢子減數(shù)分裂的各個(gè)時(shí)期均觀察到非正常細(xì)胞學(xué)現(xiàn)象，整體看第二次減數(shù)分裂的非正常細(xì)胞比例高于第一次減數(shù)分裂?；毂扼w雜種ACC-1-1異常染色體細(xì)胞比例高于八倍體ACC-1-2。

圖3 體細(xì)胞雜種及其融合親本的染色體數(shù)目Figure 3 Chromosomes of somatic hybrids and their fusion parents

表2 體細(xì)胞雜種花粉母細(xì)胞的異常染色體行為Table 2 Abnormal meiosis of somatic hybrids

在終變期對(duì)雜種染色體配對(duì)形式進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，終變期體細(xì)胞雜種花粉母細(xì)胞的染色體構(gòu)型復(fù)雜，大部分花粉母細(xì)胞含有“8”字形、“X”形、單價(jià)體等異常染色體配對(duì)構(gòu)型（圖4 a，b）；雜種第一次減數(shù)分裂的異常行為主要包括落后染色體（圖4 c,f,h）同源染色體不分離（圖4 d），末期I的異常行為有染色體不均等分裂（圖4 e），染色體橋（圖4 g）等。在第二次減數(shù)分裂中，出現(xiàn)兩極染色體行為不同步（圖4 i,j,n），落后染色體（圖4 k），互相垂直的紡錘體（圖4 l），個(gè)別細(xì)胞的紡錘體呈品形分布（圖4 m），染色體橋（圖4 p）等，在末期II，體細(xì)胞雜種的表現(xiàn)較為復(fù)雜，有不同數(shù)目微核的異常四分體（圖4 o,r），多分孢子（圖4 q），此外，如圖4 s所示，同一花藥中既有正常的四分體，也有五分體。在花粉粒時(shí)期，可以觀察到異常的花粉粒（圖4 t）。

圖4 馬鈴薯體細(xì)胞雜種的小孢子發(fā)育Figure 4 Microsporogenesis of somatic hybrids

2.4 體細(xì)胞雜種的花粉活力

采用醋酸洋紅染色法對(duì)體細(xì)胞雜種及其親本的花粉活力進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，融合親本C9701的花粉染色率為91.4%，AC142-01為85.9%，而體細(xì)胞雜種ACC-1-1和ACC-1-2分別只有28.8%和40.2%（圖5）。從圖5還可以看出，兩親本的花粉形態(tài)大多呈現(xiàn)飽滿的圓形（圖5 a,b），只有少數(shù)異常的小花粉不能被醋酸洋紅染色。而體細(xì)胞雜種在同等條件下，能夠被染色的花粉少，即使有被染色的花粉著色也較淺，大部分花粉粒呈不規(guī)則皺縮形態(tài)（圖5 c,d）。兩個(gè)雜種株系相比，ACC-1-2比ACC-1-1的能夠著色花粉比例高，亦有少數(shù)形態(tài)相對(duì)飽滿的花粉粒。

2.5 體細(xì)胞雜種表型

圖5 融合親本及體細(xì)胞雜種的花粉特征（標(biāo)尺代表100 μm）Figure 5 Pollen characteristics of fusion parents and two somatic hybrids（bars=100 μm）

表3 體細(xì)胞雜種及親本的形態(tài)學(xué)特征Table 3 Morphology of somatic hybrids and their parents

在植株生長(zhǎng)期間，對(duì)雜種植株及其親本部分植物學(xué)性狀進(jìn)行對(duì)比觀察。結(jié)果表明，從整體看，兩個(gè)體細(xì)胞雜種系的大部分性狀介于融合親本之間（表3），從生長(zhǎng)勢(shì)的角度講雜種表現(xiàn)出較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)。其株型直立（圖6 A），葉片肥厚濃綠，莖稈粗壯，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)。葉形、花形、花色、株高、匍匐莖長(zhǎng)度均表現(xiàn)為中間類型。兩個(gè)雜種系的匍匐莖長(zhǎng)度，雖長(zhǎng)于栽培種親本，但比野生種親本匍匐莖短得多。兩雜種間的大部分性狀相似，但有少數(shù)性狀有一定差異，如分枝數(shù)、株高、生育期等存在一定差異（表3，圖6）。

2.6 青枯病抗性和低溫糖化抗性鑒定

2.6.1 青枯病抗性鑒定

試驗(yàn)以融合親本、體細(xì)胞雜種及兩個(gè)對(duì)照系先后進(jìn)行了3次青枯病抗性鑒定。結(jié)果表明，感病親本AC142-01和感病對(duì)照8#表現(xiàn)為高度感病，植株全部萎蔫?？共∮H本C9701和抗病對(duì)照3C28-1表現(xiàn)為抗病。體細(xì)胞雜種ACC-1-1較多葉片萎蔫，但其感病程度低于感病親本。體細(xì)胞雜種ACC-1-2表現(xiàn)為抗病，其抗病程度高于抗病親本和抗病對(duì)照（表4，圖7）。

2.6.2 雜種塊莖抗低溫糖化能力鑒定

將收獲后的親本AC142-01及體細(xì)胞雜種的塊莖，分別在4℃和20℃貯藏，在0 d、15 d及30 d后進(jìn)行油炸加工品質(zhì)鑒定（圖8）。結(jié)果表明，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，無(wú)論是20℃貯藏還是4℃貯藏，其油炸薯片的色澤與0 d對(duì)比均有加深，但4℃貯藏條件下的加深程度要比20℃嚴(yán)重。但從圖8可以看出，兩個(gè)體細(xì)胞雜種與抗低溫糖化對(duì)照AC142-01相比沒(méi)有顯著差異。

圖6 體細(xì)胞雜種和親本的植株性狀Figure 6 Plant characteristics of somatic hybrids and parents

表4 青枯菌生理小種1號(hào)菌株接種體細(xì)胞雜種及其親本21 d后的植株發(fā)病情況Table 4 Disease indices and disease incidence recorded 21 d after root inoculation by race 1 of R.solanacearum

在油炸鑒定的同時(shí)，相同貯藏時(shí)間樣品進(jìn)行還原糖含量分析。結(jié)果顯示，塊莖中還原糖含量的變化趨勢(shì)與薯片色澤的變化趨勢(shì)基本一致（圖9）。20℃貯藏期間，塊莖還原糖含量無(wú)明顯變化，均低于0.5 mg∕g FW。4℃貯藏30 d時(shí)，親本C9701的塊莖還原糖含量呈顯著上升的趨勢(shì)，達(dá)到了4.97± 0.08 mg∕g FW。

另外3個(gè)基因型塊莖還原糖含量也隨著低溫貯藏時(shí)間的增加而上升，親本AC142-01上升速度較緩慢，在整個(gè)低溫貯藏期間均小于3.0 mg∕g FW。雜種株系A(chǔ)CC-1-1、ACC-1-2在4℃貯藏30 d后，還原糖含量分別為3.40±0.01 mg∕g FW和4.00± 0.04 mg∕g FW。盡管雜種塊莖還原糖含量高于親本AC142-01，但仍然在油炸加工的指標(biāo)范圍內(nèi)。

圖7 體細(xì)胞雜種接種21 d后的發(fā)病情況Figure 7 Plant morphology of somatic hybrids and their parents 21 d after root inoculation by race 1 of R.solanacearum

圖8 油炸薯片顏色Figure 8 Potato chip color

圖9 馬鈴薯塊莖還原糖Figure 9 Reducing sugar content of potato tubers

3 討論

利用原生質(zhì)體融合技術(shù)將野生種或近緣栽培種的優(yōu)良性狀導(dǎo)入栽培種，已成為馬鈴薯資源創(chuàng)制的重要途徑之一[16,17]。然而，由于受培養(yǎng)反應(yīng)的限制，一般均選擇一個(gè)原生質(zhì)體培養(yǎng)相對(duì)容易的基因型和一個(gè)具有目標(biāo)性狀的基因型進(jìn)行融合，獲得具有單個(gè)目標(biāo)性狀的雜種。本研究采用抗低溫糖化的二倍體栽培種系A(chǔ)C142-01和抗青枯病野生種C9701通過(guò)原生質(zhì)體融合，以期獲得既抗青枯病同時(shí)又具有低溫糖化抗性的體細(xì)胞雜種。前期獲得的兩個(gè)體細(xì)胞雜種目標(biāo)性狀鑒定結(jié)果表明，雜種ACC-1-2同時(shí)整合了雙親的目標(biāo)性狀，ACC-1-1具有較好的抗低溫糖化能力，但青枯病抗性只有一定改善。盡管如此，本研究仍然可以說(shuō)明，通過(guò)原生質(zhì)體融合獲得雙目標(biāo)性狀的雜種是可能的。從理論上講，原生質(zhì)體融合的每個(gè)雜種均應(yīng)含有融合雙親的全部遺傳信息，但本研究涉及的兩個(gè)來(lái)自于同一愈傷組織的雜種，其青枯病抗性和抗低溫糖化水平均存在差異，表明在融合中發(fā)生了遺傳信息的丟失，前人的相關(guān)研究也認(rèn)為，體細(xì)胞雜種的抗性降低或喪失與來(lái)源于親本的某些染色體片段的丟失或者缺失有關(guān)[18]。Chen等[10]通過(guò)SSR分析體細(xì)胞雜種的遺傳組分顯示，盡管是對(duì)稱融合雜種，但同一組合的所有體細(xì)胞雜種均不同程度地發(fā)生了雙親遺傳信息的丟失。

原生質(zhì)體融合再生的體細(xì)胞雜種的染色體數(shù)目偏離雙親染色體數(shù)目之和的現(xiàn)象在馬鈴薯上普遍存在[19-21]。超倍性植株產(chǎn)生的原因可能是體細(xì)胞融合過(guò)程中并非是一對(duì)一的細(xì)胞發(fā)生融合，而是三個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的融合，進(jìn)一步發(fā)育成植株的原因[22]。本研究獲得的雜種ACC-1-1與ACC-1-2從同一愈傷組織發(fā)育而來(lái)，但它們卻具有不同的倍性水平，說(shuō)明該愈傷組織可能并不是由單個(gè)融合細(xì)胞發(fā)育形成，而是由不同倍性的細(xì)胞形成的嵌合愈傷組織。

體細(xì)胞雜種的染色體組成較為復(fù)雜，使減數(shù)分裂出現(xiàn)染色體配對(duì)異常、染色體不分離或染色體不均等，從而使雜種的育性降低甚至完全敗育[23]。經(jīng)觀察，本研究的兩個(gè)體細(xì)胞雜種減數(shù)分裂過(guò)程中有較高頻率的多價(jià)體、落后染色體等異?，F(xiàn)象，形成了大量皺縮的、大小不同的花粉粒，花粉活力較低，表明他們要進(jìn)行進(jìn)一步利用還需要進(jìn)一步改良。

很多報(bào)道顯示，體細(xì)胞雜種總有一些表現(xiàn)為生長(zhǎng)勢(shì)弱的現(xiàn)象，認(rèn)為是雙親親緣關(guān)系較遠(yuǎn)導(dǎo)致遺傳不平衡所致[10]。本研究的兩個(gè)體細(xì)胞雜種則表現(xiàn)出生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)的正雜種優(yōu)勢(shì)，表明體細(xì)胞雜種可能與有性雜種相似也具有雜種優(yōu)勢(shì)。

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Assessment of Potato Somatic Hybrids with Resistances to Bacterial Wilt and Cold-induced Sweetening

LI Qiong,WANG Haibo,CAI Xingkui,LEI Ting,LIU Jun＊
(College of Life Science and Technology/Key Laboratory of Horticultural Plant Biology(HAU),Ministry of Education/National Center for Vegetable Improvement(Central China),Huazhong Agricultural University,Wuhan,Hubei 430070,China)

Two potato clones ACC-1-1 and ACC-1-2,derived from the protoplast fusion of diploid Solanum tuberosum AC142-01(2n=2x=24)and an S.chacoense clone C9701(2n=2x=24),were identified as somatic hybrids.ACC-1-1 proved tobeamixoploidandACC-1-2beanoctoploidbylowcytometeranalysisandchromosomecounting.Thesetwohybridscould bloom,but a high frequency of abnormal meiosis of the pollen mother cells was observed in each phase of the pollen development,which might be the reason for a lower pollen vitality.The results also demonstrated thatACC-1-2 exhibited high resistance to bacterial wilt and ACC-1-1 performed a moderate resistance in addition to that they were both resistant to cold-induced sweetening of the tubers,strongly suggesting that protoplast fusion,combined with suitable selection,could stackelitetraitsoftwogeneticdistantparentswhicharesexuallyincompatible.

potato;somatic hybrid;bacterial wilt;cold-induced sweetening

S532

A

1672－3635（2013）06-0321-10

2013-10-25

國(guó)家公益性農(nóng)業(yè)科研專項(xiàng)（201303007），國(guó)家“863”計(jì)劃（2006AA100107、2002AA207011）和IRT13065資助。

李瓊（1987-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)轳R鈴薯生物技術(shù)育種。

柳俊，教授，研究方向?yàn)轳R鈴薯生物技術(shù)育種，E-mail:liujun@mail.hzau.edu.cn。