周園，王嵐，李旗，馮偉，劉新*

(1.沈陽醫(yī)學(xué)院遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)實驗室，遼寧 沈陽 110034；2.沈陽市第四人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科)

噬菌體是感染細(xì)菌的病毒，具有溶原性和裂解性兩種生長方式[1]，根據(jù)與宿主菌的相互關(guān)系，分為溫和噬菌體和毒性噬菌體二種類型。過去人們關(guān)注毒性噬菌體裂解宿主菌，期待發(fā)揮治療性應(yīng)用，但長期研究并未取得實質(zhì)性進展[2]。鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii，Ab)為非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，廣泛分布于外環(huán)境中，黏附力極強，是引起醫(yī)院內(nèi)感染的重要條件致病菌之一，在住院患者特別是重癥監(jiān)護室(intensive care unit，ICU)患者中引起嚴(yán)重感染，本研究對臨床分離的Ab菌株進行耐藥性分析及細(xì)菌超微結(jié)構(gòu)觀察，結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集 標(biāo)本分別來自沈陽市多家醫(yī)院ICU，包括患者痰、呼吸機導(dǎo)管及手術(shù)的引流管等，臨床檢查判定為Ab，經(jīng)LB肉湯培養(yǎng)基增菌，然后轉(zhuǎn)種于青霉素+諾氟沙星培養(yǎng)基上培養(yǎng)。單個菌落經(jīng)中國藍(lán)培養(yǎng)基，44 ℃連續(xù)傳代純化，生化反應(yīng)測定符合不動桿菌屬，細(xì)菌鑒定儀鑒定到種。將經(jīng)過鑒定的菌株通過肉湯培養(yǎng)基增菌24 h，比濁法調(diào)細(xì)菌的密度為1×108/ml，備用。

1.2 試劑與儀器 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，中國藍(lán)培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限公司)，革蘭陰性桿菌鑒定試劑條(REF 32100 梅里埃公司)，藥敏紙片(OXOID 公司)。質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心，Ab標(biāo)準(zhǔn)株：ATCC 19606(寶特生物公司代購)，本室保存?zhèn)鞔TB細(xì)菌鑒定儀(法國生物梅里埃公司)，S-4800冷場發(fā)射掃描電鏡(日立公司北京辦事處)。

1.3 菌種鑒定 標(biāo)本直接涂片，革蘭染色；氧化酶、觸酶、硝酸鹽還原試驗及動力試驗。ATB生化鑒定分析儀鑒定，操作步驟按照說明書進行。

1.4 藥敏試驗 采用K-B 紙片擴散法，判定標(biāo)準(zhǔn)按照CLSI 2012版執(zhí)行[3]。

1.5 掃描電鏡標(biāo)本制備 將具有泛耐藥的菌株以1 200 rpm離心2 min，得到細(xì)菌集團，取少量轉(zhuǎn)入盛有預(yù)冷的2.5%戊二醛固定劑EP(eppendorf)管中固定，4 ℃過夜。4 ℃條件下0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗15 min×3次，1%鋨酸固定液固定2 h，0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗15 min×3次，脫水：50%乙醇15～20 min，70%乙醇15～20 min，90%乙醇15～20 min，90%乙醇、90%丙酮(1∶1)15～20 min，90%丙酮15～20 min。固化：37 ℃過夜。鍍膜20 s。S-4800冷場發(fā)射掃描電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗 45株Ab對抗生素的藥敏試驗見表1。

表1 45株Ab對抗生素的藥敏試驗(%)

2.2 耐藥Ab超微結(jié)構(gòu)觀察 經(jīng)呼吸機導(dǎo)管分離的耐藥Ab表面可見數(shù)個噬菌體附著，噬菌體頭部呈多邊形，未見尾絲結(jié)構(gòu)，菌體完整無破損，對照株菌體表面光滑，未見噬菌體吸附，見圖1。

3 討論

目前報告Ab的耐藥機制比較復(fù)雜，包括耐藥酶或稱藥物滅活酶的產(chǎn)生；外膜蛋白的減少、缺失或突變；藥物外排泵的形成；藥物作用靶位：青霉素結(jié)合蛋白表達減低或缺乏及可移動遺傳元件參與的耐藥基因的傳遞等，但關(guān)于Ab形態(tài)結(jié)構(gòu)與耐藥性關(guān)系鮮有報告。

噬菌體在自然界廣泛分布，凡是有細(xì)菌的場所，就有相應(yīng)噬菌體的存在。噬菌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)一般分成三種類型：即無尾部結(jié)構(gòu)的二十面體，有尾部結(jié)構(gòu)的二十面體和線狀體[4]。本試驗中觀察到Ab耐藥株的噬菌體為多邊形，未見尾絲結(jié)構(gòu)，故應(yīng)屬無尾部結(jié)構(gòu)的二十面體噬菌體，本室保存的Ab標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19606，為細(xì)菌生物被膜模式株[5]，未見噬菌體存在，藥敏試驗表明對多種抗生素敏感，提示耐藥菌株上的溫和噬菌體與其耐藥有關(guān)。

溫和噬菌體是指噬菌體感染細(xì)菌后，并不裂解宿主菌引起死亡，關(guān)于溫和噬菌體與不動桿菌溶原性及與耐藥相關(guān)性目前未見有報道。我們觀察到噬菌體吸附于Ab表面，菌體形態(tài)完整，無裂解跡象，說明宿主菌處于溶原狀態(tài)，如果噬菌體將其自身的基因組整合于宿主菌中的染色體中，這種整合意味著宿主菌基因組變化，是否因此導(dǎo)致耐藥性有待于進一步研究。

值得注意的是電鏡下還觀察到Ab存在性菌毛多重接合現(xiàn)象。呈分枝狀的性菌毛，使接合的機會更多，這種現(xiàn)象未見有文獻報道。因為性菌毛能在細(xì)菌之間傳遞DNA，是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的原因之一，本實驗結(jié)果提示溶原性細(xì)菌可能通過噬菌體啟動耐藥基因，而由性菌毛多重接合，將耐藥基因廣泛傳遞使細(xì)菌快速產(chǎn)生了耐藥性，應(yīng)予以關(guān)注。

多邊形噬菌體吸附于細(xì)菌表面，每一菌體表面均有數(shù)個噬菌體吸附，噬菌體頭部直徑小于200nm菌體形態(tài)保持球桿狀，無細(xì)胞壁破裂A 臨床分離的耐藥菌株菌體球桿狀，表面光滑，無細(xì)胞壁破裂B ATCC19606(實驗室保存株)菌毛附著于菌體：短而直、中空管狀，末端有多處分枝C 耐藥的Ab菌毛菌體間可見分枝的菌毛呈多向接合D Ab耐藥株多向接合

圖1 Ab掃描電鏡圖片(×25 000)

參考文獻：

[1]李凡，劉晶星．醫(yī)學(xué)微生物學(xué)[M]．7版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：68-77．

[2]梁莉，楊洪江，金鑫．鮑曼不動桿菌烈性噬菌體的分離與純化[J]．生物學(xué)雜志，2010，27(4)：88-90，93.

[3]孫長貴，王輝．抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(M100-S22)[J]．中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2012，32(3)：172.

[4]聞玉梅．精編現(xiàn)代醫(yī)學(xué)微生物學(xué)[M]．上海：復(fù)旦大學(xué)出版社，2002：123.

[5]Gaddy JA，Andrew P，Tomaras AP，et al．The Acinetobacter baumannii 19606 OmpA protein plays a role in biofilm formation on abiotic surfaces and in the interaction of this pathogen with eukaryotic cells [J]．Infect Immun，2009，77(8)：3150-3160．