孫　瑜，　韓　姝，　王俊杰，　夏照帆

(第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院燒傷科，上海 200433)

炎癥是機體對感染、體內抗原抗體結合以及機械損傷的一種自身反應。適度的炎癥反應是有益的，而過度的或持續(xù)的炎癥反應則會引起組織損傷和誘發(fā)疾病。糖皮質激素(glucocorticoid, GC)可以糾正炎癥反應的失調，在臨床中廣泛使用。然而過度或不適當地應用GC也會產生不良反應，引起兒童生長遲緩，免疫抑制，高血壓，延緩傷口愈合，骨質疏松以及代謝紊亂等[1]。因GC療效不滿意而需要大劑量和長期使用激素替代療法是臨床過度使用GC的最常見原因。近幾年的研究表明，體內在應激或某些疾病狀態(tài)下產生的抵抗GC抗炎作用的細胞因子是GC療效不滿意的關鍵影響因素，其中已證實的就是巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration-inhibitory factor, MIF)。MIF是一種主要由巨噬細胞激活的T細胞及垂體前葉促腎上腺皮質素細胞等合成和分泌的多功能細胞因子，參與細胞增殖、細胞遷移等多種病理生理反應[2]。迄今為止，MIF是唯一被認為能負向調節(jié)GC抗炎作用的細胞因子，它可能與局部或全身炎癥、自身免疫性疾病等密切相關，亦可能是GC不能有效發(fā)揮抗炎作用的關鍵因子[2]。MIF是如何抵抗糖皮質激素的抗炎作用的，其機制至今仍未完全闡明。本研究采用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)技術阻斷細胞內MIF蛋白的表達，觀察其對糖皮質激素抑制細胞釋放脂質炎癥介質的影響及可能機制。

材　料　和　方　法

1材料

小鼠腹腔巨噬細胞系RAW264.7由本實驗室保存；地塞米松(dexamethasone，Dex)由第二軍醫(yī)大學病理生理學教研室盧建教授惠贈；重組的小鼠MIF細胞因子購自R&D；兔抗小鼠Annexin 1抗體購自Santa Cruz；兔抗小鼠的胞漿磷脂酶A2α(cytosolic phospholipase A2α,cPLA2α)和磷酸化cPLA2α(p-cPLA2α)抗體購自Cell Signaling；HRP標記的小鼠β-actin單克隆抗體購自Sigma；羊抗小鼠的前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)和白三烯B4(leukotrienes B4, LTB4)的ELISA試劑盒購自Adlitteram Diagnostic Laboratories。針對小鼠MIF的RNA干擾質粒及質粒轉化的TOP10穿刺菌由南京金思特公司提供；經過篩選的MIFsiRNA序列為： 5’-GGATCCCGTTCATGTCGTAATAGTTGATGTTGATATCCGCATCAACTATT-ACGACATGAATTTTTTCCAAAAGCTT-3’。對照(control) siRNA為：5’-GGATCCCATCTTGCCGATGCTGTGCAGGTTGATATCCGCCTGCACAGCATCGGCAAGATTTTT-TTCCAAAAGCTT-3’。質粒轉染試劑LipofectamineTM2000購自Invitrogen。

2方法

2.1細胞培養(yǎng)RAW264.7細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，隔天傳代。

2.2去激素血清制備參照文獻[3]用葡聚糖包被的木炭吸附(dextran-coated charcoal，DCC)方法進行。過程如下：分別稱取活性炭2 g和Dextran T-70 200 mg，用去離子水定容至100 mL，用在磁力攪拌機上攪拌1 h后，以4 000 r/min離心10 min，去上清后在離心管內加入100 mL小牛血清，并與沉淀混勻，在磁力攪拌機上攪拌30 min后，在超速離心機中，20 000 r/min，離心15 min，重復1次后將上清與無酚紅的RPMI-1640混合，過濾除菌后，置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3免疫熒光法觀測siRNA轉染效率轉染前24 h消化細胞，傳代于6孔板，第2天按LipofectamineTM2000轉染試劑說明書操作，按照濃度梯度加入綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標記的siRNA， 熒光siRNA轉染RAW264.7細胞，6 h后PBS沖洗1次，倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.4RT-PCR檢測MIF mRNA的表達MIF引物(341 bp)：正義鏈5’-ACACCAATGTTCCCCGC-3’, 反義鏈5’-AAGCGAAGGTGGAACCGT-3’；β-actin引物 (211 bp)：正義鏈5’-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3’，反義鏈5’-GTACTCCTGCTTGCTGATGC-3’。Trizol提取總RNA，將mRNA逆轉錄成cDNA。在普通PCR儀上擴增目的DNA，條件為:MIF，94 ℃ 2 min, 51 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s(30個循環(huán))；β-actin，94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s(34個循環(huán))，最后于72 ℃延伸10 min。PCR產物于1～2%瓊脂糖凝膠中電泳并拍照。

2.5ELISA方法檢測上清中PGE2和LTB4的含量不同濃度的LPS、MIF和Dex刺激RAW264.7細胞后檢測培養(yǎng)上清中PGE2和LTB4含量的變化。或先加入Dex或Dex+MIF孵育1 h，在給予LPS刺激4 h后檢測上清中PGE2和LTB4的變化。

2.6Western blotting測定蛋白水平收集全細胞蛋白標本，常規(guī)BCA方法進行蛋白定量。制備12%聚丙烯酰胺凝膠，進行SDS-PAGE(2 h)，轉移到NC膜(50 min)，室溫5%BSA封閉1 h，與目標蛋白抗體孵育4 ℃過夜，TBST洗膜3次，加HRP偶聯(lián)的Ⅱ抗(1∶5 000)，孵育90 min，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光液顯色曝光。

3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0進行統(tǒng)計學處理，計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析。方差齊性時使用SNK法，方差不齊時采用Dunnett’C方法作多重比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結　　果

1MIFsiRNA表達載體的轉染效率

siRNA表達載體上帶有GFP，轉染24 h后用熒光顯微鏡觀察轉染效率，MIFsiRNA的轉染效率在70%左右，control siRNA的轉染效率在80%左右，見圖1。

Figure 1. The GFP expression in RAW264.7 macrophages 24 h after transfection with control siRNA (A) orMIFsiRNA (B) observed under fluorescence microscope (×100).

圖1細胞轉染24h后熒光顯微鏡觀測GFP表達

2MIFsiRNA干擾效率的檢測

圖2可見MIFsiRNA質粒以劑量依賴性方式降低了RAW264.7細胞中MIF mRNA的量，當加入2.0 mg/LMIFsiRNA質粒轉染細胞后，MIF基因完全沉默(P<0.01)。如圖3所示，MIFsiRNA轉染細胞后MIF蛋白表達顯著降低，且有明顯的劑量效應關系。當加入2.0 mg/LMIFsiRNA質粒轉染細胞后，胞漿中幾乎沒有MIF蛋f白表達(P<0.01)。

從上述2個實驗的結果我們得出，MIFsiRNA質粒(2.0 mg/L)瞬時轉染細胞48 h后可完全阻斷MIF基因的翻譯和蛋白表達，得到MIF基因敲除的RAW264.7細胞，下面的實驗我們將采用此濃度進行RNA干擾后的細胞處理。

3MIFsiRNA對Dex抑制PGE2和LTB4產生的影響

如圖4所示，在轉染了control siRNA質粒的細胞中，100 nmol/L的Dex對PGE2的抑制作用能達到30%，而在轉染了MIFsiRNA的細胞中，只需要10 nmol/L Dex就能達到相同的效果(圖4A)。同樣，在轉染了MIFsiRNA質粒的細胞中，10 nmol/L Dex對LTB4產生的抑制率為20%，而對轉染了control siRNA質粒的細胞則需要100 nmol/L Dex才能達到同樣的效果(圖4B)。上述結果表明內源性MIF表達被抑制的細胞，對Dex抑制PGE2和LTB4的作用的敏感性較對照組明顯增強(約10倍)。

Figure 2. The effect ofMIFsiRNA expression plasmid transient transfection on MIF mRNA expression in RAW264.7 macrophages.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vs0.5 mg/LMIFsiRNA;##P<0.01vs1.0 mg/LMIFsiRNA.

圖2MIFsiRNA質粒瞬時轉染對RAW264.7細胞中MIFmRNA表達的影響

Figure 3. The effect ofMIFsiRNA plasmid transient transfection on MIF protein expression in RAW264.7 macrophages.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vs2.0 mg/LMIFsiRNA;##P<0.01vs1.0 mg/LMIFsiRNA.

圖3MIFsiRNA質粒瞬時轉染對RAW264.7細胞中MIF蛋白表達的影響

Figure 4.MIFknockdown endanced Dex-induced inhibiton of PGE2(A) and LTB4(B) production in RAW264.7 macrophages.*P<0.05,**P<0.01vscontrol siRNA.

圖4抑制細胞內源性MIF表達能增強Dex抑制PGE2和LTB4產生的作用

4MIFsiRNA對Dex上調Annexin1表達的影響

如圖5所示，MIFsiRNA轉染RAW264.7細胞48 h后，與對照組相比， Dex誘導Annexin 1蛋白表達的作用變得更明顯(P<0.01)，并呈現劑量依賴性，表明在內源性MIF表達減少的情況下，拮抗Dex作用的細胞因子減弱，因而放大了Dex對Annexin 1表達的促進作用。

Figure 5. The effect ofMIFsiRNA on Annexin 1 expression in RAW264.7 macrophages induced by Dex.**P<0.01vsDex 0 nmol/L;△△P<0.01vsDex 1 000 nmol/L;##P<0.01vsDex 100 nmol/L.

圖5MIFsiRNA對Dex誘導RAW264.7細胞Annexin1表達的影響

5MIF逆轉Dex抑制的cPLA2α磷酸化

外源性MIF能夠逆轉Dex對cPLA2α磷酸化的抑制作用，而減少內源性MIF的表達能增強Dex對cPLA2α磷酸化的抑制作用(圖6)。在LPS刺激下，cPLA2α的磷酸化水平明顯升高(圖6B、D)，Dex能明顯抑制由LPS引起的cPLA2α磷酸化，但加入外源性MIF則能逆轉Dex對cPLA2α磷酸化的抑制作用。相反，如果減少內源性MIF表達，Dex對LPS引起的cPLA2α活化的抑制作用就更為明顯(圖6C、D)。

討　　論

MIF最早被認為是T細胞來源的淋巴因子，因能抑制巨噬細胞的遷移而得名。隨后研究表明除了T細胞外，其它合成和釋放MIF的細胞還有巨噬細胞、各種組織實質細胞和間質細胞。人類MIF基因位于22號染色體，由3個外顯子和2個內含子組成。MIF是含115個氨基酸、分子量為12.5 kD的蛋白質，它與已知的蛋白質之間無明顯的氨基酸同源性，不屬于任何已知的細胞因子家族，并且具有多種生物學功能。MIF不僅作為重要的細胞因子參與機體的炎癥及免疫反應，而且和細胞的生長及分化有著密切的聯(lián)系[4]。越來越多的文獻表明，MIF涉及機體各種炎癥性、自身免疫性疾病及多種腫瘤的發(fā)病機制[5-6]。MIF的另一個重要特點是具有拮抗GC抑制炎癥的作用[2]。MIF不但在全身多種炎癥性疾病中高表達，而且還能拮抗GC的抗炎作用，然而目前大多數炎癥性疾病臨床上仍需依賴GC治療，因而MIF的存在可能大大減弱了GC對于炎癥性疾病的療效。

體外研究證實MIF能負向調節(jié)GC抑制TNF-α、IL-1等促炎細胞因子的產生和釋放，但對于脂質炎癥介質的調節(jié)作用未見報道。我們的研究首先證實應用MIFsiRNA減少細胞內源性MIF蛋白表達能夠增強GC抑制脂質炎癥介質PGE2和LTB4的釋放。

Figure 6. MIF counter-regulated Dex-induced inhibition of cPLA2α phosphorylation. A, B, C: Western blotting; D: semiquantitative analysis of p-cPLA2α/cPLA2α;**P<0.01vscontrol siRNA;##P<0.01vsMIF;△△P<0.01vscontrol;▲▲P<0.01vsLPS.

圖6MIF對Dex抑制cPLA2α磷酸化的影響

這一結果表明MIF參與了脂質炎癥介質的調控，對MIF拮抗GC抗炎作用的內容作了一定的補充。

相對于MIF來說，人們對GC的研究歷經幾十年，已研究證實GC與GC受體(glucocorticoid receptor，GR)特異結合后，分別經3條信號轉導通路(MAPK、NF-κB和Annexin 1-cPLA2α)來抑制促炎細胞因子和脂質炎癥介質的產生和釋放[1]。以往研究發(fā)現MIF正是通過干擾了GC的經典信號通路從而負向調節(jié)GC抗炎作用。GC可通過快速、持續(xù)誘導絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶1(MAP kinase phosphatase-1, MKP-1)表達，進而反饋抑制p38活化，而在轉錄后水平抑制促炎細胞因子的基因表達。MKP-1屬于MKP家族的一員，能夠通過去磷酸化MAPK的絲/蘇氨酸殘基而使MAPK失活。MKP-1在機體中組成性表達，但能被GC強誘導。GC通過誘導MKP-1基因表達及減少MKP-1蛋白降解使MKP-1合成增加。Aeberli等[7]發(fā)現在MIF基因敲除動物的腹腔巨噬細胞中，內源性或重組的MIF可對抗GC誘導的MKP-1表達，可造成p38 MAPK持續(xù)活化。而p38 MAPK的持續(xù)活化即可通過調節(jié)活化蛋白1的活性在轉錄水平調節(jié)細胞因子表達。Roger等[8]也發(fā)現在RAW264.7巨噬細胞系，重組MIF對GC誘導的MKP-1表達具有負調控作用。上述研究表明MKP-1成為MIF拮抗GC抗炎作用的關鍵蛋白之一。

此外，研究發(fā)現，GC通過與胞漿中的GR結合為復合物并轉移到核中，促進IκB的轉錄，從而抑制炎癥介質的釋放。而IκB是一種阻礙蛋白，可阻礙免疫細胞胞漿中的轉錄因子NF-κB的釋放，如果IκB崩解則NF-κB可釋放并活化，轉移到胞核中激活炎癥因子的轉錄。MIF正是通過抑制GC對胞漿中IκBα表達的上調，以對抗激素在NF-κB/IκB信號轉導通路中的效應，進而阻斷了其對炎癥因子表達的限制作用[9]。這就表明IκBα也成為了MIF拮抗GC作用的關鍵靶點。

除了上述2個重要的信號轉導通路之外，GC-GR復合物還能介導Annexin 1-cPLA2α信號通路。Annexin 1，又叫膜聯(lián)蛋白1或脂皮質素1，是一種抗炎蛋白，正常情況下通過與cPLA2α發(fā)生作用而抑制其活性[10-11]。cPLA2α在炎癥刺激下激活，表現為從胞漿移動到核膜周圍，并將磷脂水解成花生四烯酸。GC能誘導并激活Annexin 1，通過抑制cPLA2α來阻止花生四烯酸的產生和向類花生酸類物質的轉變(如前列腺素、血栓素、前列環(huán)素和白三烯)。前面的實驗結果已經初步證實MIF能夠抵抗糖皮質激素抑制脂質炎癥介質PGE2和LTB4的釋放，那么MIF抵抗糖皮質激素的抗炎作用是否也和此信號通路相關呢？我們研究發(fā)現MIFsiRNA能夠增強Dex誘導Annexin 1的表達，進而抑制Annexin1下游蛋白cPLA2α的磷酸化，表明在內源性MIF表達減少的細胞中，拮抗Dex作用的因素減弱，因而放大了Dex對Annexin 1表達的促進作用。Annexin 1的表達增加更增強了對其下游蛋白cPLA2α磷酸化的抑制作用，最終減少PGE2和LTB4的釋放。

MKP-1和IκBα作為GC誘導的抗炎蛋白，也是MIF對抗GC抗炎作用的靶蛋白，我們的研究結果首次顯示Annexin 1可能也是MIF拮抗GC抗炎作用的關鍵蛋白。Annexin 1作為GC誘導的抗炎蛋白之一，其在胞漿內信號轉導通路中的位置和MKP-1以及IκBα十分相似，都是信號通路中的上游蛋白。鑒于這3個細胞信號通路中的上游蛋白均在MIF負向調節(jié)GC抗炎作用機制中扮演重要角色，因此通過增強其中一個蛋白的活性只能部分對抗MIF抵抗GC的作用，從而也說明了MIF在細胞內作用的廣泛性和有效性。

本研究初步揭示了MIF負向調節(jié)GC抗炎作用的關鍵性分子是GC誘導的抗炎蛋白Annexin 1，即MIF可能通過干擾GC誘導Annexin 1的表達及其下游信號通路來對抗GC本身的抗炎作用。闡明這個分子機制，有助于更全面地了解GC不能有效發(fā)揮抗炎作用的原因，為臨床解釋某些炎癥性疾病存在的GC療效不滿意現象提供實驗室依據。

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