馬 麗，張雅崢，盧 奎,2

(1.河南工業(yè)大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,河南 鄭州 450001； 2.河南工程學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院,河南 鄭州 450007)

近年來，乳腺癌在女性中的發(fā)病率較高，每年約有7.9萬新增乳腺癌患者，占女性惡性腫瘤的比例最高，對女性健康造成了嚴(yán)重威脅.目前，人們對于一些抑癌基因與DNA的相互作用機(jī)制已經(jīng)較為清楚[1]，但對有關(guān)BRCA2基因中關(guān)鍵肽段BRC與靶肽之間相互作用的研究較少.BRC肽與靶肽之間的相互作用，可能直接影響乳腺癌的發(fā)病率，所以研究二者的相互作用模式和機(jī)制對乳腺癌的治療有著重要意義[2-3].

1 BRCA2結(jié)構(gòu)特征及類BRC肽設(shè)計(jì)

乳腺癌易感基因2(BRCA2)是一種重要的抑癌基因，定位于13號染色體長臂12～13區(qū)，可參與多種基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，是修復(fù)DNA損傷的一種關(guān)鍵蛋白，其在蛋白庫的編號(PDB ID)為1NOW.已有研究表明，多數(shù)乳腺癌患者體內(nèi)的BRCA2發(fā)生突變，故BRCA2與乳腺癌有直接關(guān)系[4].當(dāng)基因突變產(chǎn)生異常時(shí)，BRCA2蛋白失去活性不能行使其功能，最終導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生[5].在雙鏈DNA斷裂修復(fù)的過程中，BRCA2起著關(guān)鍵作用.BRCA2在行使其功能時(shí)，通過與RAD51的相互作用達(dá)到DNA修復(fù)效果[6].從其分子結(jié)構(gòu)上看，BRCA2基因包含著高比例的重復(fù)序列，這在人類基因中是十分罕見的.這種高度重復(fù)的DNA序列可以導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定和重排，最終導(dǎo)致基因產(chǎn)物的缺乏而產(chǎn)生癌癥.BRCA2基因包含了3 418個(gè)氨基酸殘基，其中有8個(gè)序列高度保守的重復(fù)基元(BRC1～BRC8)，每個(gè)重復(fù)基元均含有35個(gè)氨基酸殘基:

BRC1: NHSFGGSFRTASNKEIKLSEHNIKKSKMFFKDIEE

BRC2: NEVGFRGFYSAHGTKLNVSTEALQKAVKLFSDIEN

BRC3: FETSDTFFQTASGKNISVAKESFNKIVNFFDQKPE

BRC4: KEPTLLGFHTASGKKVKIAKESLDKVKNLFDEKEQ

BRC5: IENSALAFYTSCSRKTSVSQTSLLEAKKWLREGIF

BRC6: FEVGPPAFRIASGKIVCVSHETIKKVKDIFTDSFS

BRC7: SANTCGIFSTASGKSVQVSDASLQNARQVFSEIED

BRC8: NSSAFSGFSTASGKQVSILESSLHKVKGVLEEFDL

多種癌癥細(xì)胞中都存在這些重復(fù)基元，表明BRC為BRCA2的重要功能區(qū)[7].研究結(jié)果表明，8個(gè)BRC重復(fù)基元具有一定規(guī)律的結(jié)構(gòu)，都含有以下保守序列：

-------F-TASGK-(I/V)-(I/V)S---L-K----(L/F)-(D/E)---

其中,每個(gè)“-”代表一個(gè)氨基酸殘基，其余位點(diǎn)氨基酸符合以上規(guī)律[8].考慮到個(gè)別氨基酸的化學(xué)性質(zhì)以及肽鏈形成二級結(jié)構(gòu)的傾向，對保守序列中某些特定位點(diǎn)的“-”進(jìn)行改造，就可以得到與靶肽相互作用更強(qiáng)的類BRC肽[9].對BRC肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造時(shí)，需要根據(jù)氨基酸側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)，遵循一定原則進(jìn)行設(shè)計(jì).已有文獻(xiàn)報(bào)道，側(cè)鏈帶有-NH2,-COOH和苯環(huán)的氨基酸性質(zhì)較為活潑，容易與靶肽產(chǎn)生更強(qiáng)的相互作用[10]，所以將重復(fù)基元BRC中的某一個(gè)或者某一類氨基酸替換成側(cè)鏈性質(zhì)活潑的氨基酸，則可以得到相互作用更強(qiáng)的類BRC肽[11-12].

2 p 53基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

p53是人體中研究較多的抑癌基因產(chǎn)物，其蛋白庫編號為1TUP，有腫瘤抑制器之稱.p53具有重要的生理功能，它在行使功能時(shí)需要BRCA2及其產(chǎn)物的調(diào)控[13-14].在p53中，包含5個(gè)高度保守的區(qū)域(13～19，117～142，171～192，236～258，270～286)[15]，它們的突變會(huì)使細(xì)胞分裂紊亂.以p53(117～142，171～192)為例，序列分別為GTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCP與EVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQ.這些關(guān)鍵肽段由不同的氨基酸通過肽鍵連接，某些位點(diǎn)上的氨基酸由于其側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的性質(zhì)，導(dǎo)致該位點(diǎn)成為與BRCA2相互作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵位點(diǎn)，若這些位點(diǎn)上的氨基酸發(fā)生突變，則可導(dǎo)致該保守區(qū)域的肽段與目標(biāo)肽鏈相互作用強(qiáng)弱發(fā)生明顯改變[16-17].因此，研究這些關(guān)鍵位點(diǎn)可為了解其行使功能的模式提供有用信息，進(jìn)而為發(fā)現(xiàn)治療癌癥的肽類藥物提供新的思路[18].

3 RAD51基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

RAD51是一種重要的DNA修復(fù)蛋白，蛋白庫編號為1B22，是研究較為廣泛的抑癌基因產(chǎn)物.RAD51在行使其功能時(shí)也受到了BRCA2的調(diào)控，已有的RAD51-BRC4晶體結(jié)構(gòu)顯示，RAD51某些位點(diǎn)上的關(guān)鍵氨基酸與BRC4存在著相互作用，如第205位上的Tyr，第247位上的Arg和第251位上的Met，這些關(guān)鍵位點(diǎn)上的氨基酸殘基與類BRC肽上的Phe和Glu作用較強(qiáng).如果這些關(guān)鍵位點(diǎn)發(fā)生突變，就會(huì)導(dǎo)致該基因失活，從而導(dǎo)致癌癥生成.RAD51中191～220和231～260為關(guān)鍵肽段，其序列為YARAFNTDHQTQLLYQASAMMVESRYALLI和DYSGRGELSARQMHLARFLRMLLRLADEFG，將這些關(guān)鍵肽段作為靶肽，研究其與類BRC肽相互作用的基本化學(xué)規(guī)律將具有重要意義[19].

4 類BRC肽與靶肽及其他生物大分子相互作用的主要研究方法

在類BRC肽行使其功能時(shí)，需要與靶肽或其他生物大分子相互作用，由于某些位點(diǎn)上氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)不同，導(dǎo)致二者相互作用的強(qiáng)度不同；當(dāng)氨基酸殘基側(cè)鏈中芳環(huán)所處的環(huán)境不同時(shí)，其相互作用強(qiáng)度也將發(fā)生變化.因此，可以從作用時(shí)間、溫度、濃度等方面研究它們相互作用的方式和作用規(guī)律[20].常用的研究方法主要有紫外-可見吸收光譜法、熒光光譜法和圓二色光譜法.

4.1 紫外-可見吸收光譜法

紫外-可見吸收光譜是研究生物大分子之間相互作用的一種常用方法，它的特點(diǎn)是操作簡便、現(xiàn)象直觀.利用紫外-可見吸收光譜法研究類BRC肽與靶肽相互作用時(shí)，可以固定靶肽的濃度，改變類BRC肽濃度，將二者配制成一系列不同濃度比的混合液，以Tris-HCL(pH值=7.4)緩沖液作參比，兩者結(jié)合后會(huì)導(dǎo)致Tyr及Trp所處的環(huán)境發(fā)生改變，變得更加裸露或者更加封閉，所以270 nm左右的特征吸收峰強(qiáng)度將發(fā)生變化或位移, 據(jù)此可以判斷它們之間是否發(fā)生了相互作用及相互作用的方式，進(jìn)而可確定其作用機(jī)理，并可以測定相互作用的結(jié)合常數(shù)，同時(shí)也可研究時(shí)間、溫度對相互作用的影響.通常，兩條肽之間發(fā)生作用后在電子吸收光譜上一定會(huì)發(fā)生變化，反之則不一定成立[21].周光明[22]利用紫外光譜法研究了阿司匹林與DNA的相互作用，結(jié)果表明阿司匹林與DNA相互作用的主要結(jié)合模式是嵌入作用.為了確定大黃類有效成分在體內(nèi)的代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)過程，何梅等[23]利用紫外光譜法研究了中藥大黃有效成分與牛血清蛋白的相互作用，結(jié)果表明，大黃素、大黃酸、大黃酚與BSA的結(jié)合常數(shù)分別為K=1.47×105，K=5.00×105，K=1.18×104，與文獻(xiàn)報(bào)道一致.

4.2 熒光光譜法

熒光光譜法作為一種快速靈敏的光譜方法，也是研究生物分子之間相互作用的主要手段[24].由于蛋白質(zhì)和多肽中含有帶芳環(huán)的氨基酸殘基，所以可以發(fā)生熒光.當(dāng)類BRC肽與生物大分子結(jié)合時(shí)，芳環(huán)所處的環(huán)境發(fā)生變化，導(dǎo)致熒光增強(qiáng)或減弱，而分子間的碰撞可以導(dǎo)致熒光猝滅.熒光的猝滅分為動(dòng)態(tài)和靜態(tài)兩種，靜態(tài)猝滅是由于猝滅劑與熒光物質(zhì)在基態(tài)時(shí)生成了不發(fā)熒光的復(fù)合物而導(dǎo)致的熒光猝滅；動(dòng)態(tài)猝滅是熒光物質(zhì)分子在激發(fā)態(tài)時(shí)跟猝滅劑分子相碰撞而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的猝滅.如果二者體系是動(dòng)態(tài)猝滅，則根據(jù)Stern-Volmer方程[25]：F0/F=1+t0Kq[Q]=1+Ksv[Q]，以F0/F對靶肽濃度作圖可得到一擬合直線.由直線的斜率可得到類BRC肽對靶肽體系的熒光猝滅常數(shù)Ksv.生物大分子的熒光壽命約為10-8s[26]，可求出類BRC肽對靶肽的熒光猝滅速率常數(shù)Kq.若Kq遠(yuǎn)大于生物大分子之間最大的碰撞常數(shù)2×1010L·mol-1·s-1，則類BRC肽對靶肽體系的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅[27-28].馬美湖[29]用熒光光譜法研究了核黃素與核黃素結(jié)合蛋白的相互作用，利用核黃素對RBP的熒光猝滅效應(yīng)，測定了兩者在不同條件下的結(jié)合常數(shù)、熱力學(xué)參數(shù)及結(jié)合過程中能量轉(zhuǎn)移.結(jié)果表明，核黃素對RBP的熒光猝滅機(jī)理屬于靜態(tài)猝滅，兩者主要靠氫鍵和范德華力相結(jié)合.細(xì)胞型朊蛋白是由PRNP基因編碼的一種糖蛋白，其錯(cuò)誤折疊或者聚集而形成淀粉狀纖維致病型朊蛋白，該過程不可逆，而一旦轉(zhuǎn)變，就具有了強(qiáng)抵抗力和異常復(fù)制增值的能力.黃承志[30]利用熒光光譜法研究了多肽與朊蛋白的相互作用，結(jié)果表明，在合適的酸堿環(huán)境下，多肽與蛋白之間可以形成鹽橋，所以可以穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu).

4.3 圓二色光譜法

圓二色光譜(CD)是研究核酸與蛋白質(zhì)構(gòu)象常用的一種方法，可以得到生物大分子的二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu).該方法對手性分子的結(jié)構(gòu)十分敏感，可反映出含手性非對稱分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)的一些信息，是測定生物大分子構(gòu)象及其變化的有效方法，因而CD法已成為研究分子構(gòu)型及分子間相互作用的重要光譜手段之一[31].手性分子都具有光學(xué)活性，可使偏振光震動(dòng)面發(fā)生偏轉(zhuǎn).對于蛋白質(zhì)和多肽，由于含有L型或D型氨基酸殘基，故具有光學(xué)活性，在CD譜中產(chǎn)生吸收差值.王洋[32]利用圓二色譜法研究了2,4-二氯苯酚與人血清蛋白的相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入DCP之后，HAS中α螺旋結(jié)構(gòu)的含量減少，肽鏈有所伸展，表明HAS的構(gòu)象和所處微環(huán)境發(fā)生了變化.王群[33]利用圓二色譜法研究了重組內(nèi)皮抑素與蘆薈大黃素的相互作用，結(jié)果表明重組內(nèi)皮抑素與蘆薈大黃素作用后，CD光譜中的負(fù)峰紅移到207 nm，α-螺旋含量下降到2.3%，β-折疊含量增大至64.8%，拐角結(jié)構(gòu)含量下降到1.2%，表明蘆薈大黃素結(jié)合蛋白后引起其微構(gòu)象的變化，破壞了一些α-螺旋結(jié)構(gòu)，增加了一些β-折疊結(jié)構(gòu).張?jiān)t等[34]利用圓二色譜法探討了雙陽離子咔唑衍生物與 DNA 的結(jié)合方式，發(fā)現(xiàn)該化合物先以插入方式與 DNA 結(jié)合，當(dāng)濃度逐漸增大時(shí)，以溝槽方式與 DNA 結(jié)合.劉靜[35]利用圓二色譜法研究了脂肪酸鏈碳數(shù)為15的表面活性素(Surfactin-C15)對牛血清蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明與傳統(tǒng)的表面活性劑相比，脂肪酸鏈碳數(shù)為15的表面活性素對牛血清蛋白影響是溫和的.

5 結(jié)論

靶肽p53和RAD51是已發(fā)現(xiàn)的研究較廣泛的基因產(chǎn)物，具有重要的生理功能，其在行使功能的過程中涉及與多種生物大分子的相互作用，需要BRCA2及其產(chǎn)物的調(diào)控.根據(jù)BRCA2的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可以利用紫外-可見吸收光譜、熒光光譜及圓二色譜方法研究其與靶肽相互作用的模式、作用機(jī)制等.隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將涌現(xiàn)更多的技術(shù)，可以更好地研究抑癌基因與生物大分子之間的相互作用.

參考文獻(xiàn)：

[1] Steven A N，William D F. BRCA1 and BRCA2: 1994 and beyond[J].Nature Reviews Cancer, 2004(4):665-676.

[2] 胡銳，魏陽，蔣文軍，等. BRCA2基因與RAD51基因的常見多態(tài)位點(diǎn)與乳腺癌的關(guān)系研究[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)，2008, 39(6): 973-975.

[3] 于鵬飛. BRCA2在乳腺良惡性疾病中的表達(dá)研究[D]. 遼寧: 中國醫(yī)科大學(xué)，2010.

[4] 陳東祥，李軍川，王茁，等. BRCA2在散發(fā)性乳腺癌組織中的表達(dá)及意義[J]. 武漢大學(xué)學(xué)報(bào)，2007, 28(3): 359-361.

[5] 薛麗，楊芳，張賀龍，等.Centrobin與BRCA2蛋白間相互作用及其細(xì)胞定位[J]. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2009, 25(11): 1017-1023.

[6] 黃勇，羅力. BRCA2及P53在散發(fā)性乳腺癌中的表達(dá)[J]. 內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志，2008, 40(7): 780-784.

[7] Marmorstein L Y, Ouchi T, Aaronson S A.The BRCA gene product functionally interacts with p53 and RAD51[J]. Proceedings of the National Academy of Science,1998, 95(23): 13869-13874.

[8] Yang H J, Jeffrey P D, Miller J, et al. BRCA2 function in DNA bingding and recombination from a BRCA2-DSS1-ssDNA structure[J]. Science, 2002(297):1837-1848.

[9] Graham B, Gos M, Michael R.The BRC repeats are conserved in mammalian BRCA2 proteins[J]. Human Molecular Genetics, 1997, 6(1): 53-58.

[10] Pellegrini L, Yu D S, Thomas L, et al. Insights into DNA recombination from the structure of a Rad51-BRCA2 complex[J]. Nature, 2002(420): 287-293.

[11] 林勇. DNA雙鏈斷裂修復(fù)基因BRCA2多態(tài)性及環(huán)境因素與女性肺癌的流行病學(xué)研究[D].福州: 福建醫(yī)科大學(xué)，2011.

[12] 陳瑩. ERα，ERβ與P53調(diào)控BRCA2轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制研究[D]. 上海: 復(fù)旦大學(xué)，2009.

[13] Lin H R, Ting N S Y, Qin J, et al. M phase-specific phosphorylation of BRCA2 by polo-like kinase 1 correlates with the dissociation of the BRCA2-P/CAF complex[J].Journal of Biological Chemistry, 2003, 278(38): 35979-35987.

[14] Xia B, Sheng Q, Nakanishi K, et al. Control of BRCA2 cellular and clinical functions by a muclear partner, PALB2[J]. Molecular Cell, 2006(22):719-729.

[15] Ulrich R, Ivan A, Stephen C W.Defective DNA repair and neuro-degenerative disease[J]. Cell, 2007, 130(6): 991-1004.

[16] 陳萍. 家族性卵巢癌及乳腺癌組織中BRCA2基因突變的檢測[D]. 鄭州: 鄭州大學(xué)，2002.

[17] 萬福強(qiáng). 散發(fā)性乳腺癌BRCA2基因突變的研究[D]. 南寧: 廣西醫(yī)科大學(xué)，2007.

[18] Wade H J, Stephen J，Elledge. The DNA damage response: ten years after[J]. Molecular Cell, 2007(28):739-744.

[19] Smith D D, Saha S, Fang G, et al. Modifications to the N-ter- minus but not the C- terminus of calcitonin gene-related peptide produce antagonists with increased affinity [J].Medical Chemistry,2003, 46(12): 24-28.

[20] 萬紅艷，張亞鋒，陳敬華，等. 蘆薈大黃素與 DNA相互作用的紫外光譜和電化學(xué)研究[J]. 分析測試學(xué)報(bào)，2007, 26(1): 59-61.

[21] 趙玉芬. 生物有機(jī)質(zhì)譜[M]. 鄭州：鄭州大學(xué)出版社，2005.

[22] 康倩倩，周光明. 拉曼和紫外光譜法研究阿司匹林及其與DNA的相互作用[J]. 光譜學(xué)與光譜分析，2012,32(5):699-702.

[23] 何梅，夏之寧，陰永光，等. 紫外光譜研究中藥大黃有效成分與牛血清蛋白的相互作用[J]. 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2004, 21(6): 429-432.

[24] 張霞，倪永年. 熒光光譜法研究羅丹明 B與 DNA的相互作用[J]. 南昌大學(xué)學(xué)報(bào)：理科版，2007, 31(3):268-272.

[25] 馬貴斌，高飛，任斌知，等.熒光法研究藥物分子與人血清白蛋白的結(jié)合作用[J].化學(xué)學(xué)報(bào)，1995, 53(12):1193-1197.

[26] 楊曼曼，楊頻，張立偉. 熒光法研究咖啡酸類藥物與白蛋白的作用[J]. 科學(xué)通報(bào)，1994, 39(1):31-35.

[27] 李志良，陳建華，章開誠，等. Schiff堿非鉑抗癌絡(luò)合物初步篩選的熒光法研究[J]. 中國科學(xué)(B輯), 1991(11):1193.

[28] 王瑞瓊，鄢遠(yuǎn)，黃堅(jiān)鋒. 熒光法研究絲裂霉素C與DNA的作用機(jī)制[J]. 化學(xué)學(xué)報(bào)，1999(57):171.

[29] 武小芬，蔡朝霞，孫術(shù)國，等. 熒光光譜法研究核黃素與核黃素結(jié)合蛋白的相互作用[J]. 光譜學(xué)與光譜分析，2012, 32(3): 719-722.

[30] 黃承志，胡萍萍，甄淑君. 多肽與朊蛋白相互作用研究[J]. 中國科學(xué)，2010, 40(6): 733-738.

[31] Balti R, Nedjar A N, Nasri M, et al. Three novel angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory peptides from cuttlefish (Sepia officinalis ) using digestive proteases[J]. Food Research International, 2010, 43(4): 1136-1143.

[32] 王洋，陳艷萍，張業(yè)中. 2,4-二氯苯酚與人血清蛋白相互作用的研究[J]. 化學(xué)與生物工程，2011, 28(5): 28-33.

[33] 王群，石晶，張煥，等. 熒光光譜和圓二色譜研究重組內(nèi)皮抑素與蘆薈大黃素的相互作用[J]. 分析化學(xué)研究報(bào)告，2005, 33(7): 909-912.

[34] 張?jiān)t，孫渝明，劉鑫，等. 雙陽離子咔唑衍生物與 DNA相互作用的光譜研究[J]. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2010, 31(9): 1860-1863.

[35] 劉靜. 表面活性素與生物大分子之間相互作用的研究[D]. 上海: 華東理工大學(xué)，2009.