賈振偉 張家新 安磊 吳中紅 田見暉

（1.內(nèi)蒙古民族大學動物科技學院，通遼 028000；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，北京 100193；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，呼和浩特 010018）

C型尿鈉肽（C-type natriuretic peptide，CNP）與心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）和腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）同屬于尿鈉肽家族成員，最初于1990年在豬的大腦中被分離提純［1］，廣泛分布于動物大腦、腎臟、心臟及血管等組織，具有維持心血管系統(tǒng)功能穩(wěn)態(tài)、調(diào)控細胞增殖及促進骨骼生長等作用。值得注意的是，近年在小鼠中研究發(fā)現(xiàn)卵泡壁層顆粒細胞能夠分泌CNP，通過結(jié)合卵丘顆粒細胞上的受體產(chǎn)生cGMP進入卵母細胞，從而維持高水平cAMP抑制卵母細胞減數(shù)分裂［2］。目前，家畜卵母細胞體外成熟后發(fā)育能力較差，為了促進胞質(zhì)成熟、提高體外發(fā)育能力，國內(nèi)外普遍采用減數(shù)分裂抑制劑處理卵母細胞，然后進行體外成熟、受精及胚胎培養(yǎng)，但是一般認為這些減數(shù)分裂抑制劑沒有促進卵母細胞體外發(fā)育，甚至產(chǎn)生了不利的影響。CNP由22個氨基酸殘基組成，是生理性多肽物質(zhì)，相對于化學合成的減數(shù)分裂抑制劑危害性應較小，將可能替代傳統(tǒng)的減數(shù)分裂抑制劑用于建立家畜卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系。此外，最近研究發(fā)現(xiàn)，CNP能夠促進小鼠卵泡發(fā)育，而且增加了促性腺激素處理后的排卵數(shù)量［3］?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，我們認為CNP在作為生理活性的減數(shù)分裂抑制劑促進家畜卵母細胞體外發(fā)育及超數(shù)排卵增強劑提高超排效率方面將具有潛在的利用價值。

1 C型尿鈉肽結(jié)構(gòu)

CNP是由22個氨基酸殘基組成的多肽（CNP-22），其核心部分含有一個由17個氨基酸通過二硫鍵組成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)環(huán)能夠與受體結(jié)合，對維持CNP生物活性十分重要［4］。CNP是鈉肽家族中最保守的成員，不僅物種間氨基酸序列高度一致，而且前體氨基酸序列也高度保守。例如，在牛、人、豬和小鼠中，成熟CNP氨基酸序列基本一致。人類的CNP前體（proCNP）含有103個氨基酸殘基，細胞內(nèi)蛋白酶furin可用于proCNP產(chǎn)生具有生物功能的由53個氨基酸組成的多肽（CNP-53）［5］。在某些組織中，CNP-53被一種未知的細胞外酶分解為CNP-22。體內(nèi)成熟的CNP以CNP-53和CNP-22兩種形成存在，其中CNP-22為循環(huán)的活性形式，而CNP-53為其儲存形式，CNP主要以CNP-22形式發(fā)揮生物學作用［6］。

2 C型尿鈉肽受體

目前，普遍認為哺乳動物鈉尿肽家族有3種受體：NPR1、NPR2和NPR3（或NPRA、NPRB和NPRC）。NPR1、NPR2為鳥苷酸環(huán)化酶偶聯(lián)受體（也稱GC-A、GC-B受體），NPR-3為鈉肽清除受體。鈉尿肽主要通過NPR-1和NPR-2受體介導發(fā)揮生物學作用，激活偶聯(lián)的鳥苷酸環(huán)化酶，使GTP轉(zhuǎn)化為cGMP調(diào)控下游靶物質(zhì)。研究認為CNP是目前已知唯一的NPR-2天然配體，其結(jié)合NPR2的能力比ANP大50倍，比BNP大500倍［7］。NPR3與3種鈉肽結(jié)合能力基本一致。

NPR2蛋白細胞膜外結(jié)構(gòu)與生長因子受體相似，大約由450氨基酸殘基組成，主要起連接CNP的作用，跨膜區(qū)域為20-25氨基酸殘基序列，細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)由大約570個氨基酸殘基組成。而且，細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)由激酶同型區(qū)域（KHD）、卷曲螺旋狀的二聚體及鳥苷酸環(huán)化酶催化區(qū)域組成。

3 C型尿鈉肽作用機制

CNP與受體NPR2膜外蛋白區(qū)域結(jié)合后，使細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的KHD去磷酸化、構(gòu)象發(fā)生變化，同時結(jié)合ATP激活鳥苷酸環(huán)化酶，將GTP轉(zhuǎn)化為cGMP，然后激活下游信號通路。一般認為CNP引起細胞內(nèi)反應依賴第二信使cGMP，目前研究證實cGMP能夠結(jié)合3種蛋白激活下游生理反應，分別為cGMP依賴蛋白激酶G（PKG）、cGMP結(jié)合磷酸二酯酶（PDEs）、環(huán)核苷門控離子通道蛋白。

當前對CNP通過cGMP轉(zhuǎn)導的信號通路研究比較清楚的是激活具有絲氨酸、蘇氨酸激酶活性的PKG引起生物學反應［8］。PKG基因有PKGI、PKGII兩種亞型。PKGI屬于細胞內(nèi)溶質(zhì)，主要在血小板、平滑肌、心臟及大腦表達，研究表明同源重組敲除PKGI基因?qū)е滦∈笱芷交∷沙诩坝g小鼠血壓升高［9］；PKGII主要位于細胞膜上，在腸、腎臟、軟骨組織、大腦及骨骼表達較高，敲除PKGII基因?qū)е滦∈蠛痛笫笊L矮小［10］。磷酸二酯酶（PDEs）家族主要由11個成員組成，能夠降解環(huán)核苷酸為5'核苷一磷酸，是環(huán)核苷酸的關(guān)鍵調(diào)控者。目前研究認為，cGMP能夠引起PDEs構(gòu)象發(fā)生變化，調(diào)控其活性。例如，cGMP結(jié)合PDE5后促進了cGMP的分解，PDEs構(gòu)象變化也能激起cAMP和cGMP信號對話。例如，cGMP結(jié)合PDE2導致細胞內(nèi)cAMP含量下降；相反，cGMP抑制PDE3活性，增加細胞內(nèi)cAMP含量。

此外，cGMP也能通過調(diào)控環(huán)核苷門控離子通道蛋白介導細胞內(nèi)反應。這些離子通道蛋白C端含有環(huán)核苷位點結(jié)合區(qū)域，能夠結(jié)合cAMP或cGMP。但是，目前CNP與環(huán)核苷門控離子通道蛋白相關(guān)聯(lián)的功能數(shù)據(jù)尚未見報道。

4 C型尿鈉肽在動物繁殖過程中的作用

Sudoh 等［11］首先對豬大腦中的CNP進行了分離鑒別，隨后研究確認其為神經(jīng)遞質(zhì)及心血管肽，由此推測CNP可能參與動物繁殖機能調(diào)控。

4.1 C型尿鈉肽在雄性動物繁殖過程中的作用

4.1.1 C型尿鈉肽在雄性動物生殖器官上表達 Middendorff 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，CNP和受體在人類睪丸中均有表達。El-Gehani 等［13］研究結(jié)果顯示，CNP在胎兒期大鼠睪丸間質(zhì)細胞內(nèi)表達；近年研究發(fā)現(xiàn)大鼠出生時CNP表達量較多，然后逐漸下降，在出生后35 d表達再次增加［14］。小鼠出生后CNP表達模式與大鼠相似，出生時表達量較高，然后逐漸下降，在出生后20 d表達再次增加。Nielsen等［15］采用放射免疫方法檢測了公豬多種組織的CNP蛋白表達量，發(fā)現(xiàn)CNP在附睪、生精囊泡和前列腺等生殖器官含量最高，并且mRNA在附睪、生精囊泡比其他組織高125倍。以上研究結(jié)果說明CNP在調(diào)控雄性動物繁殖過程方面可能具有重要作用。

4.1.2 C型尿鈉肽在雄性動物繁殖過程中的調(diào)控 Chrisman等［16］研究發(fā)現(xiàn)CNP增加了豬精液的cGMP水平。由此推測CNP可能通過促進cGMP產(chǎn)生調(diào)控睪丸的內(nèi)分泌功能。隨后研究證明CNP能夠促進睪丸間質(zhì)細胞睪酮的分泌，同時也參與睪丸間質(zhì)細胞和支持細胞功能的調(diào)控［17，18］。另外，CNP還可能以旁分泌的方式通過影響曲細精管的舒張來調(diào)控精子的傳遞和睪丸血液的供應。此外，普遍認為cGMP不僅能夠調(diào)控睪丸的自分泌和旁分泌功能，同時也對陰莖勃起功能有影響。在兔子和大鼠中，CNP通過結(jié)合海綿體細胞膜上的NPR2受體，引起陰莖平滑肌肌肉細胞的松弛。Küthe等［19］發(fā)現(xiàn)，NPR2受體在人的陰莖海綿體組織中表達，說明CNP對陰莖勃起有作用。此外，體外培養(yǎng)期間，CNP促進了支持細胞表達雄激素結(jié)合蛋白、抑制素B和轉(zhuǎn)鐵蛋白，由于這些基因蛋白與血管屏障形成相關(guān)，揭示CNP可能參與了血管屏障的動態(tài)調(diào)控［14］。

4.2 C型尿鈉肽在雌性動物繁殖過程中的作用

4.2.1 C型尿鈉肽在雌性動物生殖器官上表達 Cameron等［20］利用mRNA原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)小鼠胎盤組織中CNP大量表達始于性交后10.5 d。Stepan等［21］檢測到灰鼠胚盤組織內(nèi)CNP mRNA在性交后9.5-15.5 d表達最高。大鼠胎盤CNP表達與ANP相似，在性交后16 d表達最高。胎盤、子宮以及卵巢組織間CNP表達的比較研究表明，胎盤CNP mRNA表達高于子宮和卵巢。另外，人類妊娠期胎盤組織的NPR1及NPR2表達變化幅度較大的研究結(jié)果進一步支持胎盤組織中鈉肽系統(tǒng)功能性作用［22］。

Stepan等［23］發(fā)現(xiàn)，未妊娠小鼠子宮和卵巢組織CNP mRNA的表達最高，甚至超過了大腦和腎臟組織。更加細致的研究表明，子宮內(nèi)CNP的表達受其他激素調(diào)控。例如，去勢小鼠腹膜內(nèi)注射雌激素以劑量依賴的方式促進子宮內(nèi)CNP表達［24］。大鼠子宮中CNP表達受發(fā)情期影響，而且在發(fā)情初期表達最高。CNP的表達依賴發(fā)情周期歸咎于子宮內(nèi)容物及液體內(nèi)容物質(zhì)或者雌激素的變化［25］。同樣，發(fā)情周期內(nèi)大鼠卵巢組織中CNP和NPR2表達也呈時間依賴性的變化。此外，CNP/NPR2體系在卵巢組織中表達亦受激素調(diào)控，研究表明具有FSH功能作用的eCG注射小鼠后促進了 CNP/NPR2 mRNA表達，而具有LH功能作用的hCG抑制了其表達［26，27］。

4.2.2 C型鈉肽在雌性動物繁殖過程中的調(diào)控 近年小鼠上的研究發(fā)現(xiàn)，CNP主要在卵泡壁層顆粒細胞表達，NPR2主要在卵丘顆粒細胞上表達，體外培養(yǎng)期間CNP抑制了卵母細胞減數(shù)分裂，敲除CNP基因后卵母細胞啟動了減數(shù)分裂，說明CNP是體內(nèi)在LH峰值啟動前抑制卵母細胞減數(shù)分裂的功能性物質(zhì)，其抑制減數(shù)分裂的機制是CNP作用于卵丘顆粒細胞后激活NPR2，產(chǎn)生大量的cGMP并進入卵母細胞，抑制PDE3A的活性，減少cAMP的分解，維持減數(shù)分裂的靜止［2］。另外，McGee等［28］發(fā)現(xiàn)在卵泡竇前向竇內(nèi)轉(zhuǎn)變時期，8-bromo-cGMP（一種cGMP的類似物）可以降低卵泡閉鎖，同時促進了有腔卵泡的發(fā)育。由此推測，CNP可能通過結(jié)合NPR2產(chǎn)生cGMP促進卵泡發(fā)育。最近研究結(jié)果顯示，小鼠注射CNP后促進了卵巢上早期和后期有腔卵泡發(fā)育，使用eCG超排處理后增加了排出的卵母細胞數(shù)量，并且體外培養(yǎng)后沒有影響卵母細胞發(fā)育能力［3］。一般認為FSH通過作用卵泡細胞G蛋白偶聯(lián)的腺苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生cAMP調(diào)控卵泡的生長發(fā)育，當前研究揭示CNP通過激活鳥苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生cGMP也能促進卵泡發(fā)育，但是FSH和CNP通過第二信使cAMP/cGMP是否存在交叉作用通路調(diào)控卵泡發(fā)育尚不明確。

綿羊妊娠后期子宮內(nèi)cGMP含量提高了38倍，說明激活了鈉肽系統(tǒng)，促進子宮內(nèi)cGMP的產(chǎn)生［29］。McNeill等［30］研究發(fā)現(xiàn)綿羊血液中母源CNP蛋白含量低，且穩(wěn)定存在，但妊娠后40-50 d迅速增加，在妊娠120 d時達到高峰，在產(chǎn)前7 d迅速下降至妊娠前水平。小鼠子宮CNP mRNA濃度在妊娠期提高了7倍多，而卵巢中的水平則降低到未妊娠對照組的10%。以上數(shù)據(jù)揭示妊娠期間CNP可能通過松弛平滑肌肌肉抑制子宮收縮維持妊娠過程。CNP誘導的松弛可能不依賴cGMP介導的信號通路，因為抑制NPR1和NPR2活性并沒有影響CNP對子宮肌層的作用［31］，具體的調(diào)控機制還有待進一步研究。

此外，羊妊娠期間子宮動靜脈連接高濃度的CNP，揭示子宮胎盤組織是母源CNP的主要來源。但是，目前關(guān)于子宮和胎盤各自對母源CNP的貢獻能力尚不明確。McNeill等［30］研究發(fā)現(xiàn)綿羊母源CNP含量與妊娠胎兒數(shù)量呈正相關(guān)，隨后McNeill等［32］研究結(jié)果顯示，在綿羊妊娠期間，胎盤組織是母源CNP含量的主要貢獻者，合成的CNP與胎盤成熟和胎兒發(fā)育密切相關(guān)。然而，在人類研究結(jié)果顯示，胎兒血漿CNP的含量高于母源水平，且母源與胎兒間梯度含量較低，表明母源和胎兒可能獨立產(chǎn)生CNP。因此，在妊娠期間調(diào)控胎盤成熟和胎兒發(fā)育的CNP合成在物種間可能存在差異。

5 應用前景

目前，在畜牧業(yè)生產(chǎn)方面，雄性動物存在一些繁殖障礙問題，如陰莖勃起困難。由于CNP能夠通過產(chǎn)生cGMP調(diào)控雄性動物陰莖勃起，將可能在治療此項疾病方面發(fā)揮一定的作用，提高雄性動物的繁殖力。此外，也可以開發(fā)治療男性因陽痿導致不育的藥物。

鑒于CNP能夠促進雌性動物卵泡發(fā)育，有提高排卵數(shù)量的作用，其可以在提高牛、羊等大家畜超排效率方面具有一定的利用價值。此外，目前由于家畜卵母細胞來源于卵巢上不同生長時期的卵泡，盡管體外成熟培養(yǎng)后能夠完成減數(shù)分裂，但由于脫離卵泡內(nèi)生理環(huán)境，體外難以獲得支持受精后胚胎發(fā)育的胞質(zhì)成熟，逐漸成為提高牛體外胚胎發(fā)育能力的瓶頸因素。另外，幼畜超排技術(shù)近年來有較大進展，但同樣存在胞質(zhì)不成熟導致胚胎發(fā)育能力低的問題。鑒于卵母細胞體內(nèi)成熟過程涉及的生理條件及影響因素，許多學者理論上認為體外維持卵母細胞靜止，模擬體內(nèi)LH激素刺激啟動GVBD前卵母細胞經(jīng)歷胞質(zhì)成熟的歷程，是提高受精后胚胎發(fā)育能力的一種重要的手段。但是，目前體外使用的減速分裂抑制劑沒有顯著的作用效果，一些物質(zhì)甚至具有不利影響。值得注意的是，近年來一些學者研究發(fā)現(xiàn)CNP體外能夠抑制卵母細胞減數(shù)分裂，且由于其為生理活性物質(zhì)，用于體外成熟培養(yǎng)更接近于牛卵泡內(nèi)的生理環(huán)境，對卵母細胞毒害應該小于化學合成的減數(shù)分裂抑制劑。因此，在體外用新型的減數(shù)分裂抑制劑提高卵母細胞發(fā)育能力方面將具有潛在利用價值。

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