楊 柳，朱杰麗，吳翠蓉，陸 軍，柴振林*，周利雄

(1.浙江省林產(chǎn)質(zhì)量檢測站，浙江 杭州 310023;2.江山市林業(yè)局，浙江 江山 323700)

氯吡脲是一種高活性的植物生長調(diào)節(jié)劑，主要成分為1－(2－氯－4－吡啶基)－3－苯基脲，具有促進細胞分裂、提高光合作用效率、增強抗逆性、?；ū９?、提高坐果率、果實膨大等作用，對作物采后生理也有積極作用［1－2］。目前，氯吡脲已應用于西瓜、葡萄、獼猴桃等多種農(nóng)作物，在美國、歐盟、日本等國也都允許使用。因氯吡脲可能會對人體帶來潛在的健康危害，歐盟、日本等對其殘留量作出了嚴格限定，其中日本“肯定列表”對部分漿果限量為0.02 mg/kg，而美國早在1996年便規(guī)定氯吡脲在獼猴桃中的限量為0.04 mg/kg［3］，我國在2009年也出臺了相應的農(nóng)業(yè)行業(yè)標準，對西瓜、黃瓜、獼猴桃和葡萄中氯吡脲作了限量規(guī)定［4］，但在楊梅上還沒有限量規(guī)定及成熟的測定方法。目前，有關氯吡脲檢測方法的報道主要是液相色譜法［5－7］、液相色譜-飛行時間質(zhì)譜(LC/TOF-MS)法［8］，涉及的樣品有獼猴桃、黃瓜、西瓜、葡萄、土壤等［9－10］，楊梅中氯吡脲的測定未見報道。楊梅屬楊梅科楊梅屬的亞熱帶常綠果樹，原產(chǎn)于中國東南部，是浙江省特色水果栽培面積最大，產(chǎn)量最高，品質(zhì)最佳，然而楊梅成熟于高溫多雨季節(jié)，又為漿果且無外果皮，外噴藥劑極易侵入果實可食部分，產(chǎn)生安全隱患［11－12］。

本試驗基于 NY/T 761 －2008［13］、NY/T 1680 －2009［14］用乙腈作為提取劑，高速分散器作為提取設備，氨基小柱為凈化柱，甲醇為淋洗、乙腈定容，建立了楊梅中氯吡脲殘留的基質(zhì)分散萃取——反相高效液相色譜檢測方法，可為楊梅中氯吡脲殘留限量設定及標準檢驗方法的確定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料、儀器設備與試劑 楊梅樣品來源于浙江省臨海市楊梅實驗基地。

DIONX P680高效液相色譜儀(美國戴安)，配ASI-100四元泵系統(tǒng)配置、UV170U四通道紫外檢測器，Kromasil C18(250mm ×4.6mm，5μm)不銹鋼柱，IKA T18 basic高速分散器，Autoscience AS3120A超聲波清洗器，旋轉蒸發(fā)儀(Buchi)等，氨基柱(500 mg/6mL)，固相萃取、真空裝置(Supelco)，磨樣機(Joyoung)。

甲醇、乙腈均為色譜純(Tedia Company USA)，氯化鈉為分析純。氯吡脲(98.7%)標準物質(zhì)購于Sigma公司，用流動相配制成一定濃度的標準溶液。

1.1.2 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18(250mm×4.6mm，5 μm)不銹鋼柱;以流動相∶乙腈∶水(67/33，V/V)為流動相，經(jīng)過0.45 μm的微孔濾膜過濾和超聲波脫氣處理;柱溫40℃;流速1mL/min;檢測波長265 nm;進樣量10μL;外標法定量。

1.2 樣品制備及提取、凈化

磨樣磨制楊梅樣品1 kg，從中稱取25.00 g于150mL高型燒杯中，加50mL乙腈，于高速分散器分散提取1min(15000 r/min)后過濾于預先裝有5 g氯化鈉的50mL長直試管中，蓋上蓋子劇烈振搖30 s以上，靜置30min，待分層停止后凈化。吸取上清乙腈提取液10mL于平底燒瓶中，40℃水浴旋轉蒸發(fā)干，取下后用10mL甲醇分3次洗入甲醇預洗過的固相萃取小柱內(nèi)，保持柱流速度為20 d/min，待前一次洗入液沒于柱內(nèi)時及時將下一次的注入。取出淋洗液再次旋干，5mL乙腈定容、超聲溶解，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾于進樣瓶中，待測。各處理均6次重復。

2 結果與分析

2.1 提取、凈化方法的選擇

本次試驗分別采用乙腈、甲醇作為提取劑，經(jīng)基質(zhì)分散萃取、渦旋、振蕩、超聲等方法提取。本試驗樣品中含有豐富的糖份，采用甲醇提取時過濾較慢，以致難以進行，而乙腈提取則無此現(xiàn)象且后續(xù)的測定結果良好，本試驗結合楊梅安全指標中有敵敵畏、氯氰菊酯、多菌靈等農(nóng)藥且均以乙腈作為提取劑［13－14］，最終確定以乙腈作為提取液，同時對4種提取方法進行篩選。實驗表明4種提取方法的樣品添加回收率均能達85%以上，其中基質(zhì)分散萃取法速度快、易操作，振蕩和超聲提取法較耗時，渦旋時低速振蕩不充分、高速手勢難控制。在選擇凈化小柱時，本試驗同時采用了氨基柱、弗羅里硅土柱和堿性氧化鋁柱等3種凈化柱，結果表明，3種柱子對楊梅樣品均有一定的凈化作用，但經(jīng)弗羅里硅土柱或氧化鋁柱凈化后的樣品測定液成分相對較復雜，樣品譜圖中氯吡脲的干擾峰較多，難徹底分離。采用氨基柱凈化后的測定譜圖顯示氯吡脲峰形較好，干擾峰較少，回收率佳。綜合以上試驗結果確定以乙腈作為提取劑、基質(zhì)分散萃取法作為提取方法，氨基小柱作為凈化柱［9－10］。經(jīng)試驗表明，該提取方法是切實可行的。

2.2 流動相的選擇

分析氯吡脲的分子式與分子量，選擇了C18反相鍵合相色譜柱。據(jù)文獻［9－10］報道氯吡脲測定可采用乙腈/水或甲醇/水作為流動相，本試驗比較標樣與樣品在不同比例的乙腈/水或甲醇/水流動相中的出峰情況，以甲醇/水作為流動相時氯吡脲出峰相對較慢，峰寬較寬且在氯吡脲周圍的干擾峰較多;而采用乙腈/水不僅可以明顯縮短氯吡脲的出峰時間且干擾峰少、峰形好，可明顯降低氯吡脲的檢出限。如圖1、2所示，分別以乙腈/水、甲醇/水為流動相，濃度為26.6 μg/mL的氯吡脲的出峰圖譜。

圖1 以乙腈/水為流動相的氯吡脲26.6 μg/mL色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard sample of 26.6 μg/mL forchlorfenuron by Acetonitrile/water as mobile phase

圖2 以甲醇/水為流動相的氯吡脲26.6 μg/mL色譜圖Fig.2 Chromatogram of standard sample of 26.6 μg/mL forchlorfenuron by methanol/water as mobile phase

2.3 定性分析

對氯吡脲的定性，本試驗采用對照標樣與樣品組份的保留時間及樣品中加入標樣峰疊加來確定，表1是添加濃度為25 mg/kg的樣品和濃度為26.6 μg/mL標準溶液中氯吡脲6次出峰時間對比，變異系數(shù)分別為 0.094、0.150，平均出峰時間為 4.983、4.991。利用流動相配制標準溶液分別為 0.125、0.25、5.0、25、50和100 μg/mL系列濃度的氯吡脲標準溶液，進樣10μL，其色譜峰面積與濃度呈極顯著線性相關，其線性方程與線性范圍分別為:

表1 標準溶液與樣品添加保留時間的重現(xiàn)性Tab.1 Reproducibility of retention time of standard and sample

2.4 檢測限的測定

3倍信噪比(S/N=3)時最低檢出量為1.0×10－10g，按前述樣品稱量和定容條件，本方法樣品中氯吡脲檢測限為0.01 mg/kg。

2.5 加標回收及方法精密度

準確稱取 25 g樣品6×4份 ，加入氯吡脲標液，使其濃度分別為0.00、0.04、7.5、25 mg/kg的6 次重復，輕輕振搖，使其均勻分散開。按實驗方法進行提取、凈化、濃縮、定容、檢測?？瞻讟悠?、添加回收樣品的色譜峰如圖2、圖3所示。楊梅空白樣品中未檢測到氯吡脲，添加樣品回收率結果如表2所示。

表2 添加回收率及其相對標準偏差(n=6)Tab.2 Recoveries rate and relative standard deviations(n=6)

由表2可知，氯吡脲在樣品不同濃度添加回收率在98.4% ～11%，相對標準偏差在0.97% ～2.6%，表明本方法的準確度和精密度均可滿足痕量組分測定要求，可以對楊梅中氯吡脲含量進行測定。

3 討論

楊梅果實中含有大量的水分，在選擇提取劑時考慮到極性溶劑，它能與水互溶從而滲透到組織內(nèi)部，改變?nèi)芤簶O性后又能與水分離。丙酮、甲醇是良好的提取劑，但不易與水分離;二氯甲烷、三氯甲烷對人體毒性較大，且對色素有較強的溶解性，故未選擇。相比之下乙腈是較為理想的提取劑，它不但具備上述要求的溶劑性質(zhì)，而且對試樣中的糖、脂肪和蛋白質(zhì)的溶解性較小，降低了基體中雜質(zhì)的溶出;同時，它的低揮發(fā)性也減少了對人體健康和環(huán)境的危害。已有文獻［6，15－17］報道，植物樣品中氯吡脲可采用乙腈或甲醇作為提取劑。由于甲醇和乙腈二者極性差異明顯，對不同的樣品可選擇采用，如一些含糖量較高或水溶性物質(zhì)較多的樣品宜采用乙腈，而脂溶性成分較多的樣品宜采用甲醇。本實驗所用的楊梅糖分含量較高，故采用的乙腈作為提取劑。氯吡脲測定可采用乙腈/水［16－17］或甲醇/水［6，15］作為流動相，本試驗比較標樣與樣品在不同比例的乙腈/水或甲醇/水流動相中的出峰情況發(fā)現(xiàn)，以甲醇/水作為流動相時氯吡脲出峰相對較慢，且峰寬較寬且在氯吡脲周圍的干擾峰較多;而采用乙腈/水不僅可以明顯縮短氯吡脲的出峰時間且干擾峰少、峰形好，可明顯降低氯吡脲的檢出限，這與Antonio［8］在西紅柿、南瓜、西瓜中的測定結果相似。在選擇流動相流速時，0.5mL/min時峰分離明顯優(yōu)于1mL/min但出峰時間相對較長。在選擇凈化小柱時，本試驗同時采用了弗羅里硅土柱和堿性氧化鋁柱，三種柱子對楊梅樣品均有一定的凈化作用，但經(jīng)弗羅里硅土柱或氧化鋁柱凈化后的樣品測定液成分相對較復雜，樣品譜圖中氯吡脲的干擾峰較多，難徹底分離。采用氨基柱凈化后的測定譜圖顯示氯吡脲峰形較好，干擾峰較少，與侯玉茹［18］在葡萄中的研究結果略有差異，這可能與楊梅樣品水分含量較高，所含物質(zhì)與各凈化柱的親和能力有關。本方法可結合楊梅中農(nóng)藥殘留測定一起進行前處理［13］，節(jié)省時間和有機試劑。

圖3 楊梅添加0 mg/kg氯吡脲的色譜圖Fig.3 Chromatogram of Myica rubra without forchlorfenuron as control

圖4 楊梅添加7.5 mg/kg氯吡脲的色譜圖Fig.4 Chromatogram of Myica rubra sample spiked with 7.5 mg/kg of forchlorfenuron

4 結論

通過對儀器條件和樣品處理進行優(yōu)化，建立基質(zhì)分散萃取——反相高效液相色譜法測定楊梅中氯吡脲的方法，本方法測定氯吡脲線性范圍廣，樣品中氯吡脲檢測限可達0.01 mg/kg;不同濃度添加回收率在98.4% ～110%，相對標準偏差在0.97% ～2.6%;操作簡便快捷、省時省力。

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