劉 姚，陳婷婷，傅凌韻，葉振南，李 楠，王文君

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045)

脂肪是所有生物生長和發(fā)育的重要營養(yǎng)素，能夠?yàn)闄C(jī)體提供能量，而且是生物膜的重要組成成分。膳食脂肪能夠直接或間接對多個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，這種營養(yǎng)素基因之間的作用對代謝、生長發(fā)育以及細(xì)胞分化產(chǎn)生重要的影響。由于脂肪在慢性病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用，因此闡明膳食脂肪作用于基因組的分子機(jī)制對于了解脂肪在人類健康中的作用很重要。

本實(shí)驗(yàn)在青錢柳多糖降脂動物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，通過觀察青錢柳多糖對實(shí)驗(yàn)性高脂血癥小鼠肝臟和脂肪組織中與脂代謝相關(guān)的基因脂肪酸合成酶(FAS)mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，旨在探討青錢柳多糖降血脂的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康雌性昆明種小白鼠，購自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物室(合格證號:021－9601)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

DNA Marker、10×loading buffer、Trizol試劑盒、RT-PCR試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司;RNase噴霧清除劑，北京百泰克生物技術(shù)有限公司;瓊脂糖、焦碳酸二乙酯(DEPC)，美國Promega公司;Western及IP細(xì)胞裂解液100mL、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所;考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒，南京建成生物工程研究所;脂肪酸合成酶(FAS)(一抗)(兔抗大鼠)(H-300)SC-20140，Santa Cruz公司;小鼠β-actin單克隆抗體(一抗)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(二抗)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(二抗)北京中杉生物公司;PVDF膜，美國Mllipore公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

高溫電熱干燥箱(UFE500)，Memmert公司;Centrifuge高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司;電泳儀，Bio-Rad公司;凝膠成像系統(tǒng)，英國SynGene公司;超微量紫外分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀，Thermo公司;PTC-200 PCR儀、電泳儀、垂直電泳槽，Bio-Rad公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 建立高脂血癥小鼠模型 選擇健康昆明種小鼠200只，體質(zhì)量18～22 g，正常適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，期間自由飲水飲食，飼養(yǎng)溫度為(20±2)℃，相對濕度(60±5)%，光照時(shí)間(12 h/12 h)。其中12只作為空白對照組，每日灌喂等體積的無菌水;將高脂小鼠平均分成6組，分別為高血脂模型對照組，辛伐他汀陽性對照組，辛伐他汀+青錢柳多糖中劑量組，青錢柳多糖低劑量組，青錢柳多糖中劑量組，青錢柳多糖高劑量組［1］。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取各小鼠肝臟、脂肪組織于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 肝臟和脂肪組織FAS mRNA表達(dá) 組織中mRNA的表達(dá)采用半定量PCR法檢測。根據(jù)Gen-Bank FAS基因(GenBank accession No.NM-007987)和 β －actin基因(GenBank accession No.NM-007393)設(shè)計(jì)FAS和β－actin引物。FAS上游引物:5'－CATCCAAGACACAGCTGAGCA －3'，F(xiàn)AS下游引物:5'－CCAGGAGTTGCCAATGTCAA －3';β－actin上游引物:5'－CAGGGTGTGATGGTGGGAA－3'，β－actin下游引物:5'－CGGTTGGCCTTAGGGTTC A－3'。參照試劑盒說明書，反應(yīng)體系為25μL，含上游引物(10 μM)0.5μL，下游引物(10 μM)0.5μL，2×TransTaqTM PCR SuperMix Ⅱ 12.5μL，cDNA 1μL，ddH2O 至終體積 25μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性 3min，59.3 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸 40 s，1 cycle;94 ℃變性30 s，59.3 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30 cycles;94 ℃變性30 s，59.3 ℃退火30 s，72℃延伸10min，1 cycle;4℃，2 h。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取各組織FAS、β－actin PCR產(chǎn)物，上樣于質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠(含0.05%EB)，1×TAE電泳緩沖液，160 V電泳15min，紫外燈下觀察，凝膠成像分析系統(tǒng)(SynGene)拍照。

1.4.3 肝臟和脂肪組織FAS蛋白表達(dá) 按照Western及IP細(xì)胞裂解液試劑盒說明書，提取肝臟和脂肪組織中的總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測定總蛋白濃度，調(diào)整到同一水平，采用不連續(xù)電壓進(jìn)行電泳;電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)檢測蛋白質(zhì)的完整性;采用半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜，抗體檢測并顯色，將PVDF膜吸干，拍照封存。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

用凝膠圖像分析軟件(Gene Tools Analysis)進(jìn)行光密度掃描半定量分析。計(jì)算FAS mRNA和蛋白的相對密度比值。采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析與顯著性檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠肝臟和脂肪組織總RNA提取

圖1 組織總RNA提取結(jié)果Fig.1 Results of tissue total RNA

圖2 總蛋白Fig.2 The total Protein

所提取的小鼠肝臟和脂肪組織總RNA經(jīng)紫外分析，每組樣品 OD260/OD280比值在 1.8 ～2.0，說明提取的總RNA中沒有蛋白質(zhì)等大分子污染;由圖1電泳分析每組均可見18 S和28 S兩條較深的電泳條帶，表明所提的組織總RNA純度符合分析要求。組織總蛋白凝膠電泳如圖2所示，蛋白條帶濃度均一并且數(shù)量基本一致，表明提取蛋白未發(fā)生降解，完整性較好符合下一步試驗(yàn)要求。

圖3 肝臟組織中FAS mRNA表達(dá)的RT-PCR電泳Fig.3 The RT-PCR result of the expression of FAS mRNA in liver

表1 青錢柳多糖對肝臟和脂肪組織中FAS mRNA表達(dá)的影響Tab.1 Effect of Cyclocarya paliurus(Batal)Iljinskaja polysaccharide on the expression of FAS mRNA in liver and adipose

2.2 青錢柳多糖對實(shí)驗(yàn)性高脂血癥小鼠肝臟和脂肪組織脂肪酸合成酶(FAS)mRNA表達(dá)的影響

由圖3可知，以空白對照組小鼠組織FAS mRNA表達(dá)光密度值設(shè)為1作參考，各組小鼠肝臟組織FAS mRNA表達(dá)相對光密度值(表1)分別為:模型組與空白組相比，F(xiàn)AS mRNA表達(dá)水平上升0.5%，差異不顯著;給藥各組(辛伐他汀組、辛+中劑量組、低劑量組、中劑量組、高劑量組)與空白組相比，F(xiàn)AS mRNA 表達(dá)水平下降10.9%、12%、3.4%、7.7%、16.9%，差異不顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給藥組均能輕微抑制小鼠肝臟組織中FAS mRNA表達(dá)，其中多糖高劑量組抑制效果最佳，優(yōu)于辛伐他汀+中劑量組。各組小鼠脂肪組織FAS mRNA表達(dá)相對光密度值分別為:模型對照組與空白對照組相比，下降28.1%，F(xiàn)AS mRNA表達(dá)水平差異不顯著;給藥各組(辛伐他汀組、辛+中劑量組、低劑量組、中劑量組、高劑量組)與空白對照組相比，分別下降 19.8%、14.7%、19.4%、上升 19.5%、6.2%，F(xiàn)AS mRNA 表達(dá)水平差異不顯著。

2.3 青錢柳多糖對實(shí)驗(yàn)性高脂血癥小鼠肝臟和脂肪組織脂肪酸合成酶(FAS)蛋白表達(dá)的影響

由圖4可知，以空白對照組小鼠肝臟和脂肪組織FAS蛋白表達(dá)光密度值設(shè)為1作參考，各組小鼠肝臟組織FAS蛋白表達(dá)相對光密度值(表2)分別為:模型組與空白組相比，F(xiàn)AS蛋白表達(dá)水平上升53.8%，差異極顯著(P＜0.01);青錢柳多糖高劑量組與空白組相比，F(xiàn)AS蛋白表達(dá)差異不顯著(P＞0.05)，但與高脂模型組FAS蛋白表達(dá)水平相比顯著下降，差異極顯著(P＜0.01)。高脂模型組小鼠在高脂飲食誘導(dǎo)下，其肝臟FAS蛋白表達(dá)明顯上升，給藥組相比高脂模型組均能抑制小鼠肝臟組織中FAS蛋白表達(dá)，其中多糖高劑量組抑制效果最佳。各組小鼠脂肪組織FAS蛋白表達(dá)相對光密度值分別為:模型對照組與空白對照組相比，上升17.9%，F(xiàn)AS蛋白表達(dá)水平差異不顯著(P＞0.05);給藥各組(除低劑量組外)與空白對照組相比FAS蛋白表達(dá)水平均有一定程度的下降，但差異不顯著(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，辛伐他汀組、辛伐他汀+中劑量組、青錢柳高、中劑量組均能輕微下調(diào)小鼠脂肪組織FAS蛋白表達(dá)水平，但差異不顯著。

圖4 脂肪組織中FAS基因蛋白質(zhì)表達(dá)Fig.4 Result of the expression of FAS protein in adipose

表2 青錢柳多糖對肝臟和脂肪組織中FAS蛋白質(zhì)表達(dá)的影響Tab.2 Effect of Cyclocarya paliurus(Batal)Iljinskaja polysaccharide on the expression of FAS protein in liver and adipose

3 討論與結(jié)論

脂肪酸合成酶(FAS)由乙?；D(zhuǎn)移酶(AT)、丙二?；D(zhuǎn)移酶(MT)、β－酮脂酰合酶(KS)、β－酮脂酰還原酶(KR)、β－羥脂酰脫水酶(HD)、烯脂酰還原酶(ER)及硫酯酶(TE)等7個(gè)功能域所組成，可分為I型和Ⅱ型兩種亞型。細(xì)菌和植物中的FAS屬Ⅱ型，人類及其他哺乳類動物的FAS屬I型，兩種亞型都是由包括以上7個(gè)功能域組成的一個(gè)單鏈多功能酶，為單基因所編碼，相對分子質(zhì)量為250 ku［2］。脂肪酸合成酶(FAS)是生物體內(nèi)源性脂肪酸合成過程的關(guān)鍵酶，它通過催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A而生成長鏈脂肪酸［3］，F(xiàn)AS基因的表達(dá)直接影響著脂肪酸合成酶的多寡。FAS基因在多種組織和器官中都有表達(dá)，其中在肝臟，肺臟和腹腔脂肪組織中表達(dá)較高。在正常的生理狀態(tài)下，飲食和激素可調(diào)節(jié)FAS的表達(dá)和含量［4－5］。近年來，對脂肪酸生物合成途經(jīng)進(jìn)行了大量研究，初步闡明了脂肪酸合成規(guī)律和脂肪酸合成酶在動物體脂生成、沉積中發(fā)揮重要作用［6］。

脂肪酸合成酶(FAS)作為細(xì)胞脂肪代謝的主要的酶，參與了很多疾病的發(fā)生和發(fā)展。Loftus等［7］給小鼠腹腔注射FAS抑制劑，能降低小鼠食欲、減少能量攝入，顯著減輕小鼠體重，說明FAS與脂肪調(diào)控之間存在重要聯(lián)系。曾凡勇等［8］探討了高脂飲食誘導(dǎo)下肥胖易感(OP)與肥胖抗性(OR)大鼠白色脂肪組織中脂肪酸合成酶的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)OP與OR大鼠的白色脂肪組織中存在FAS基因表達(dá)差異，其差異與大鼠發(fā)生肥胖的易感程度有關(guān)。在普洱茶的降脂減肥的作用機(jī)理方面，Chiang CT等［9］報(bào)道，灌喂普洱茶的大鼠肝臟內(nèi)脂肪酸合成酶的表達(dá)量得到顯著抑制，人肝腫瘤HepG2細(xì)胞在加入普洱茶提取物后，在蛋白和mRNA水平上，脂肪酸合成酶表達(dá)都得到抑制。孫悅等［10］在高甘油三酯高血糖血癥大鼠脂糖代謝相關(guān)酶活性變化的實(shí)驗(yàn)研究中得出模型組動物肝中FAS活性顯著升高，提示FAS活性升高可能是模型動物出現(xiàn)高甘油三酯高血糖血癥的原因之一。本研究也發(fā)現(xiàn)，青錢柳多糖具有抑制高脂血癥小鼠不同組織中FAS mRNA的豐度。但青錢柳多糖對肝臟和脂肪組織中FAS mRNA表達(dá)的影響不顯著，其可能原因是試驗(yàn)中所給的多糖劑量少;或者是在試驗(yàn)后期小鼠的體重變化較小有關(guān)。

盧辰等［11］在研究脂肪酸合成酶在糖尿病SD大鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜FAS的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平比對照組明顯增高，說明FAS在糖尿病視網(wǎng)膜病變形成過程中可能有重要作用，如果能在糖尿病視網(wǎng)膜病變背景期通過抑制FAS的表達(dá)，就可能在一定程度上減緩糖尿病的發(fā)展，為脂肪酸合成酶在糖尿病發(fā)病機(jī)制中的作用提供基因表達(dá)和免疫組織化學(xué)方面證據(jù)。Kuo等［12］發(fā)現(xiàn)普洱茶提取物能抑制HepG2細(xì)胞FAS蛋白表達(dá)，PI3K抑制劑和JNK抑制劑也能抑制FAS蛋白表達(dá)，推測作用可能是通過下調(diào)PI3K/Akt和JNK信號途徑實(shí)現(xiàn)的。他們還發(fā)現(xiàn)綠茶提取物雖然能顯著抑制肝臟FAS mRNA表達(dá)，但對FAS蛋白水平無顯著作用。這表明對FAS的調(diào)節(jié)可能是轉(zhuǎn)錄后水平。袁華兵等［13］發(fā)現(xiàn)普洱茶提取物能適度下調(diào)脂肪組織FAS mRNA表達(dá)，抑制脂肪合成，減少脂肪量。

本實(shí)驗(yàn)采用Western Blot方法研究不同劑量青錢柳多糖對實(shí)驗(yàn)性高脂血癥小鼠肝臟組織，脂肪組織中FAS基因蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)高脂飲食誘導(dǎo)的模型組小鼠肝臟、脂肪組織中FAS蛋白水平均上升，青錢柳多糖均能抑制小鼠肝臟組織和脂肪組織中FAS蛋白表達(dá)水平，但青錢柳多糖調(diào)節(jié)小鼠肝臟和脂肪組織中FAS蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)一定的差異性，推測可能與肝臟和脂肪組織中FAS活性相關(guān)，進(jìn)而反饋為FAS蛋白表達(dá)水平上的差異。Clarke［14］研究發(fā)現(xiàn)，飼喂高蛋白日糧可降低脂肪組織脂肪酸合成酶的mRNA的數(shù)量，但不影響肝臟組織脂肪酸合成酶的mRNA數(shù)量，這就會使體脂肪的沉積減少，這與本研究結(jié)果類似;同時(shí)，也可能是由于RNA穩(wěn)性差，易降解，從而導(dǎo)致RNA表達(dá)降低，而蛋白表達(dá)并沒有發(fā)生變化所致。楊欽河等［15］探討了疏肝健脾方藥對非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肝組織脂肪酸合成酶(FAS)mRNA及蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與模型組相比，各用藥組FAS mRNA表達(dá)水平和FAS蛋白表達(dá)水平均有下降。表明疏肝健脾方藥可能通過降低FAS mRNA及蛋白表達(dá)水平而改善NAFLD大鼠肝臟脂質(zhì)代謝紊亂，減輕肝損傷。

青錢柳是我國一種特有的珍稀植物，前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，青錢柳多糖具有一定的降血脂和降血糖作用，但對于其作用機(jī)理的探討較少。本研究初步發(fā)現(xiàn)，青錢柳多糖具有抑制高脂血癥小鼠FAS基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的作用，但對其他與脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響并未作探討，這有待深入的研究，以揭示青錢柳降血脂的分子機(jī)制。

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