邵殿坤 ，顧地周 ，付 航 ，張學士 ，王秋爽 ，禚玲玲 ，潘 雨

（1.吉林省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院，吉林 長春 130022；2.通化師范學院 生命科學學院，吉林 通化 134002）

羊躑躅Rhododendron molle(Blume) G. Don為杜鵑花科杜鵑花屬植物，主要分布于江西、江蘇和湖南等省地，是我國珍貴的野生藥用植物資源，具有祛濕、除風、解痛等功效，可用于治療風濕、頑癬和疼痛等癥；對農(nóng)作物蟲害的防治也有一定的作用，是開發(fā)綠色農(nóng)藥的植物源；還可作為觀賞園藝植物應用于園林綠化和杜鵑花育種之中。因羊躑躅有性繁殖種子萌發(fā)率低，以扦插、嫁接方式繁殖又存在生根率及移栽成活率極低等問題，故羊躑躅一直未得到開發(fā)與利用。目前，有關(guān)羊躑躅及其同屬其他種植物的研究已有過一些報道[1-6]，但有關(guān)羊躑躅高效快繁體系建立的研究尚未見諸報道。為給羊躑躅種苗的快速繁殖提供簡捷方法，文中以羊躑躅嫩莖段為實驗材料，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，采用均勻設(shè)計法進行實驗設(shè)計，以期通過誘導和培養(yǎng)嫩莖段腋芽叢生以建立羊躑躅種苗高效植株快繁體系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及處理方法

羊躑躅枝條由江蘇省農(nóng)業(yè)科學研究院提供，將去除頂尖的枝條進行水培，促其腋芽萌發(fā)。待腋芽長至3.00 cm時將嫩枝剪下，用75%乙醇（體積分數(shù)）涮洗10 s后移至3.0%次氯酸鈉溶液（質(zhì)量濃度）中浸泡10 min，無菌水沖洗8次，用無菌濾紙吸干表面水分以備用。

1.2 羊躑躅嫩莖腋芽叢生芽的誘導實驗

以1/2 DR為培養(yǎng)基[7]，加入蔗糖30 g·L-1，瓊脂7.0 g·L-1，將處理后的嫩枝切割成段（1葉1段），并接種到1/4 DR＋NAA 0.10 mg·L-1＋GA31.50 mg·L-1的培養(yǎng)基中再次進行腋芽誘導培養(yǎng)(培養(yǎng)條件為溫度26 ℃、光照周期14 h·d-1、光照強度1 300 lx)，待腋芽在瓶中伸長至2.50 cm時切下并切割成段，轉(zhuǎn)接至含有不同質(zhì)量濃度的異戊烯基腺嘌呤2ip、萘乙酸NAA和赤霉素GA3（預實驗確定的使用范圍分別為3.50～4.20、0.02～0.05和1.70～2.20 mg·L-1）的1/2 DR培養(yǎng)基中進行腋芽叢生芽誘導培養(yǎng)，將pH值調(diào)節(jié)至5.7，在光照強度為1 200 lx、溫度為(26±2) ℃、13 h·d-1的光照條件下進行莖段培養(yǎng)。

采用均勻設(shè)計法設(shè)計實驗[8-10]，選用U12(123)均勻表，每個處理接種10個嫩莖，重復3次，取誘導率的平均值，以確定誘導羊躑躅腋芽叢生芽形成的2ip、NAA和GA3的最佳濃度配比。嫩莖段培養(yǎng)35 d后統(tǒng)計其誘導率。

1.3 羊躑躅芽苗生根、植株高效再生和煉苗實驗

以1/4 DR為培養(yǎng)基，附加不同質(zhì)量濃度的玉米素ZT、萘乙酸NAA和吲哚乙酸IAA (預實驗確定的使用范圍分別為0.01～0.05、0.05～0.20和0.10～0.30 mg·L-1)，瓊脂7.5 g·L-1，添加蔗糖15 g·L-1，將pH值調(diào)至5.4，待腋芽叢生芽上的芽苗長至1.50 cm時，將生長健壯的芽苗從叢生芽團上切下，置于光照周期為8 h·d-1、光照強度為800 lx和溫度為(20±2) ℃的條件下培養(yǎng)。為了提高羊躑躅組培苗的生根速度和生根率，選用U10(103)均勻表，每個處理接種10個芽苗，重復3次，篩選能促使羊躑躅芽苗生根的玉米素、萘乙酸和吲哚乙酸的最佳濃度配比。芽苗培養(yǎng)35 d后統(tǒng)計其生根率。

在培養(yǎng)瓶內(nèi)，以再生植株的莖節(jié)為材料開展快繁實驗[11-12]，當小植株伸長至3.00 cm時，在無菌狀態(tài)下打開培養(yǎng)瓶，將小植株的1～2葉留下而苗干剪下，切割成段（1～2葉1段）后移到含有GA31.00 mg·L-1的生根培養(yǎng)基中，開始進行生根和腋芽萌發(fā)生長培養(yǎng)。計算出每個莖段和每瓶的增殖倍數(shù)和周期。

當小植株長至2.00～3.00 cm時，將小植株從培養(yǎng)瓶中取出放在高錳酸鉀溶液（濃度為5 mg·L-1）中洗凈根上的瓊脂，將小植株栽植到經(jīng)殺毒礬（150倍液）消毒過的草炭土、腐爛松針和河砂 (4∶2∶1)的基質(zhì)中，覆蓋塑料薄膜（透性好）進行保濕保溫處理，控制溫度為(21±2) ℃，相對濕度保持在75%，并置于14 h·d-1的自然光照條件下，中午溫度升高時適當打開薄膜換氣通風，早晚噴灑1次清水。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用均勻設(shè)計法進行實驗設(shè)計后，將實驗數(shù)據(jù)進行處理和分析，分析各激素的濃度范圍和各激素對腋芽叢生芽誘導及生根率影響的顯著性，再經(jīng)進一步實驗驗證后篩選出用于嫩莖段叢生芽苗誘導促其生根的最佳培養(yǎng)基。

2 結(jié)果與分析

用于羊躑躅腋芽叢生芽誘導的異戊烯基腺嘌呤、萘乙酸和赤霉素這3種激素及其水平的篩選實驗方案與實驗結(jié)果如表1，用于羊躑躅組培苗生根培養(yǎng)的玉米素、萘乙酸和吲哚乙酸3種激素及其水平的篩選實驗方案與實驗結(jié)果如表2；對表1與表2的數(shù)據(jù)進行回歸分析，結(jié)果如表3。

表1 羊躑躅腋芽叢生芽誘導中激素篩選的U12(123)實驗設(shè)計與實驗結(jié)果Table 1 U12(123) test design and result of hormone screening for cluster bud induction in R. molle

2.1 羊躑躅腋芽叢生芽誘導激素的篩選結(jié)果

表3中的回歸分析結(jié)果表明，檢驗值Ft＞臨界值F（0.05，3，8），說明異戊烯基腺嘌呤、萘乙酸和赤霉素對腋芽叢生芽誘導率的影響均顯著。

表2 羊躑躅組培苗生根培養(yǎng)激素篩選的U10(103)實驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 U10(103) test design and result of hormone screening for plantlets rooting in R. molle

由表3可知，異戊烯基腺嘌呤、萘乙酸和赤霉素的最優(yōu)濃度分別是4.20、0.02和2.20 mg·L-1，計算可得誘導率的最優(yōu)解析解為98.7%，優(yōu)化值估計區(qū)間為95.89%～101.51%，貢獻率分別為33.6%、2.45%和10.0%。由此可見，異戊烯基腺嘌呤對腋芽叢生芽誘導率的貢獻大于萘乙酸和赤霉素，而異戊烯基腺嘌呤和赤霉素與叢生芽的誘導率呈正相關(guān)，萘乙酸與之呈負相關(guān)。由此推測，在質(zhì)量濃度高于4.20 mg·L-1的異戊烯基腺嘌呤和赤霉素在2.20 mg·L-1以上及萘乙酸在0.02 mg·L-1以下的條件下有較高的誘導率。為了驗證此推測的可能性，又設(shè)異戊烯基腺嘌呤的質(zhì)量濃度分別為4.20、4.30、4.40、4.50、4.60、4.70、4.80、4.90和5.00 mg·L-1，赤霉素的質(zhì)量濃度分別為2.20、2.30、2.40、2.50、2.60、2.70、2.80、2.90 和 3.00 mg·L-1，萘乙酸質(zhì)量濃度分別為0.00、0.01和0.02 mg·L-1，共進行了9個水平的補充實驗，重復3次，取其平均值。按照文中1.2介紹的方法，將嫩枝切割成段（1葉1段），并接種到附加有2ip（4.20～ 5.00 mg·L-1）、GA3（2.20～ 3.00 mg·L-1） 和 NAA（0.00～ 0.02 mg·L-1） 的 1/4 DR培養(yǎng)基中進行驗證實驗；將培養(yǎng)瓶中2.50 cm的腋芽切下(如圖1a所示)，分段切割后接種到附加有異戊烯基腺嘌呤4.40 mg·L-1、萘乙酸0.01 mg·L-1和赤霉素 2.50 mg·L-1的 1/2 DR培養(yǎng)基上進行驗證實驗。培養(yǎng)12 d后發(fā)現(xiàn)，嫩莖段腋芽處開始膨脹；培養(yǎng)20 d后又發(fā)現(xiàn)，膨脹部表面出現(xiàn)顆粒狀的凸起狀；培養(yǎng)28 d后，顆粒狀凸起變形成錐狀；通過35 d的培養(yǎng)，由錐狀體生長形成了叢生芽團(如圖1b所示)；培養(yǎng)50 d后，不定芽高度可達2.00 cm以上(如圖1c所示)。實驗結(jié)果證明，當異戊烯基腺嘌呤的質(zhì)量濃度為4.40 mg·L-1、萘乙酸的質(zhì)量濃度為0.01 mg·L-1、赤霉素的質(zhì)量濃度為2.50 mg·L-1時，平均誘導率可達99.8%，叢生芽誘導率最高且芽苗形態(tài)和長勢最佳，均高于表1中12個水平的誘導率。

表3 羊躑躅叢生芽誘導和植株再生各階段的回歸分析結(jié)果?Table 3 Regression analysis result of cluster bud induction and plant regeneration in R. molle at various stages

2.2 羊躑躅組培苗生根激素的篩選、植株再生和煉苗的實驗結(jié)果

表3中的回歸分析結(jié)果還表明，檢驗值Ft＞臨界值F(0.05,2,7)，說明萘乙酸和玉米素對組培苗生根的影響顯著，而吲哚乙酸對組培苗生根的影響不顯著。

從表3中還可看出，0.05 mg·L-1是萘乙酸和玉米素的最佳濃度，在此最佳濃度基礎(chǔ)上計算出的最高生根率是96.2%，生根率的優(yōu)化值區(qū)間為93.21%～99.19%。ZT和NAA對生根率的貢獻值和貢獻率分別為：U1＝257，U1/U＝94.5%；U3＝24.0，U3/U＝8.82%。這說明玉米素對生根的貢獻遠大于萘乙酸，因為萘乙酸和玉米素與生根率分別呈負、正相關(guān)，添加質(zhì)量濃度低于0.05 mg·L-1的萘乙酸和高于0.05 mg·L-1的玉米素可能會有更高的生根率。為了確定這種可能性，又以質(zhì)量濃度分別為0.05、0.04、0.03、0.02、0.01和0.00 mg·L-1的萘乙酸和質(zhì)量濃度分別為0.10、0.09、0.08、0.07、0.06和 0.05 mg·L-1的玉米素開展了12個補充實驗，重復3次。所以，選取并切下腋芽叢生芽團上1.50 cm高、健壯的芽苗轉(zhuǎn)接到含有NAA（0.00～0.05 mg·L-1）和ZT（0.05～0.10 mg·L-1）的1/4 DR培養(yǎng)基中進行驗證實驗。于此實驗8 d后發(fā)現(xiàn)，在苗干基部靠近切口的莖部表面出現(xiàn)了微小顆粒，實驗20 d后小顆粒漸漸轉(zhuǎn)變成錐狀，27 d后錐狀伸長形成不定根，經(jīng)過35 d的培養(yǎng)，有3～5條不定根形成，并有側(cè)根出現(xiàn)(如圖1d所示)，此時發(fā)現(xiàn)，當ZT的質(zhì)量濃度為0.06 mg·L-1和NAA的質(zhì)量濃度為0.02 mg·L-1時，芽苗的生根率最高，其生根率達到99.0%以上，且比表2所列10個處理的生根率都要高。

羊躑躅高效快繁采取節(jié)增殖方式，按照1.3中介紹的方法，對生根培養(yǎng)基進行了改良，改良后的生根培養(yǎng)基即為1/4 DR＋ZT 0.06 mg·L-1＋NAA 0.02 mg·L-1＋ GA31.00 mg·L-1。實驗結(jié)果表明，經(jīng)過28 d的培養(yǎng)后，每節(jié)段平均增殖5倍以上（如圖1e所示）。

根據(jù)1.3中介紹的方法，待植株在瓶中長到2.00～3.00 cm高時開始煉苗，對小植株進行10 d的煉苗后就可將薄膜揭去，小植株可達到99.0%以上的成活率(如圖1f所示)。

圖1 羊躑躅嫩莖腋芽叢生芽誘導各階段培養(yǎng)物的形態(tài)Fig.1 Culture status at various stages of cluster bud induction from axillary bud in tender stem of R. molle

3 結(jié)論與討論

實驗結(jié)果證明，1/2 DR＋2ip 4.40 mg·L-1＋GA32.50 mg·L-1＋NAA 0.01 mg·L-1的培養(yǎng)基對羊躑躅嫩莖腋芽叢生芽的誘導效果最好，異戊烯基腺嘌呤濃度低于3.50 mg·L-1和高于4.40 mg·L-1時嫩莖腋芽叢生芽苗的誘導率均低于60.0%，這說明羊躑躅嫩莖腋芽叢生芽誘導需要適宜濃度的異戊烯基腺嘌呤，低濃度和過高濃度的異戊烯基腺嘌呤均不利于腋芽叢生芽苗的誘導；在培養(yǎng)基中添加適當濃度的萘乙酸(0.01 mg·L-1)和赤霉素(2.50 mg·L-1)可調(diào)節(jié)腋芽芽苗萌發(fā)與生長的速度。

1/4 DR＋ZT 0.04 mg·L-1＋NAA 0.02 mg·L-1的培養(yǎng)基適用于羊躑躅組培苗的生根培養(yǎng)，其生根時間短，生根率平均達到99.0%以上，但吲哚乙酸對羊躑躅生根的影響差異并不顯著。當萘乙酸低于0.02 mg·L-1時，芽苗生根率僅為45.0%；而超過0.20 mg·L-1時，苗干基部有膨脹出現(xiàn)或產(chǎn)生細胞團，培養(yǎng)一段時間后，在膨脹處或細胞團上發(fā)出不定根，植株煉苗移栽時，根隨膨脹或細胞團與苗干脫離，移栽成活率降低，此現(xiàn)象與Danielle等人[13]的研究發(fā)現(xiàn)相同，這可能是由苗干部和根的疏導纖維組織錯位連接造成的。含有1.00 mg·L-1赤霉素的生根培養(yǎng)基調(diào)節(jié)了腋芽萌發(fā)和生長的速度[14]，使其生長周期縮短而增殖倍數(shù)提高，該種方法與王雯雯等人[15]對大字杜鵑的研究結(jié)果相近。

我國珍稀的野生杜鵑資源豐富，品種繁多，但引種并人工馴化繁殖的品種甚少。羊躑躅就是具有藥用和觀賞價值的野生植物資源，快速繁殖體系的建立可為其規(guī)?；耘嗪屯茝V應用提供優(yōu)質(zhì)種苗。本研究成功完成了羊躑躅嫩莖腋芽叢生芽苗的誘導實驗，并建立了高效植株再生體系，可以滿足羊躑躅工廠化育苗的需要，也為其他野生杜鵑的工廠化育苗奠定了基礎(chǔ)，提供了方法。

參考文獻：

[1]顧宏輝,袁群英,朱春艷,等.羊躑躅的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].植物生理學通訊,2006,42(4):683.

[2]周金梅,宮敬利,建德鋒.不同激素及扦插基質(zhì)對興安杜鵑嫩枝扦插成活率的影響[J].經(jīng)濟林研究,2012,30(4):123－125.

[3]宮汝淳,姜云天,顧地周,等.短果杜鵑的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].植物生理學通訊,2008,44(1):133.

[4]顧地周,鄧志剛,綦茂偉,等.苞葉杜鵑離體培養(yǎng)及種質(zhì)試管保存體系的建立[J].南京林業(yè)大學學報,2009,33(3):20－24.

[5]梁 宇,顧地周,朱俊義,等.照白杜鵑離體快繁體系建立及種質(zhì)試管保存 [J].中南林業(yè)科技大學學報,2008,28(5):16－21.

[6]顧地周,張 琪,朱俊義.小葉杜鵑的離體快繁體系建立及種質(zhì)試管的保存[J].東北林業(yè)大學學報,2009,37(10):26－28.

[7]曹孜義,劉國民.實用植物組織培養(yǎng)技術(shù)教程[M].蘭州:甘肅科學技術(shù)出版社,2002.

[8]顧地周,羅 微,曹 遜,等.松毛翠的離體快繁體系建立及種質(zhì)試管保存研究[J].林業(yè)科學,2009,45(7):140－144.

[9]智翠梅.均勻設(shè)計及優(yōu)化[J].化工中間體,2007,(3):7－10.

[10]顧地周,朱俊義,馮 穎,等.草莓試管內(nèi)誘導匍匐莖和高溫處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)研究[J].西北農(nóng)林科技大學學報,2010,38(11):89－94.

[11]顧地周,叢小力,姜云天,等.色木槭的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].植物生理學通訊,2008,44(2):314.

[12]顧地周,叢小力,宋利麗,等.木通馬兜鈴的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J].植物生理學通訊,2008,44(1):136.

[13]Danielle J D,William E V,Kwai Y L. The anatomy of tissue cultured red raspberry prior to and after transfer to soil [J]. Plant Cell: Tissue and Organ Culture,1985,(1):43－50.

[14]李合生.現(xiàn)代植物生理學[M].北京:高等教育出版社,2002:256－258.

[15]王雯雯,馬秋月,朱俊義,等.大字杜鵑離體快繁體系建立及種質(zhì)試管保存研究[J].植物研究,2009,29(2):198－203.