邢朝斌，龍月紅，勞鳳云，莊鵬宇，修樂山

（河北聯(lián)合大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院；b.藥學(xué)院，河北 唐山 063000）

刺五加Eleutherococcus senticosus是我國傳統(tǒng)的珍貴藥用植物，其根、莖、葉均可入藥，具有增強免疫力、抗疲勞、抗衰老等多種生物活性，三萜皂苷類化合物是其主要活性成分之一[1-2]。有關(guān)研究結(jié)果表明，三萜皂苷的含量和組成隨著植物的遺傳背景、組織類型、生長年齡、生理狀況及環(huán)境因子的變化而發(fā)生顯著的變化，而其變化又取決于三萜皂苷合成途徑中的一些關(guān)鍵酶基因及其在細胞中的表達水平[2-3]。三萜皂苷類化合物在生物體中均需通過依賴甲羥戊酸的類異戊二烯進行合成[3,5]，在合成途徑中，鯊烯合酶（squalene synthase，SS）催化兩分子的法呢酰基二磷酸合成鯊烯，是三萜皂苷類化合物生物合成的第一個關(guān)鍵步驟[6]。

目前，本實驗室已經(jīng)克隆出刺五加的SS基因[7]和作為內(nèi)參照基因的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因[8]的cDNA序列，并利用基于光密度值分析的終端相對定量RT-PCR法初步分析了其表達情況[9]。但該方法將擴增效率假定為1，而實際中難以達到，從而造成了分析結(jié)果準(zhǔn)確性低的弊端[10-11]。實時定量PCR（quantitative real time PCR，qRT-PCR）技術(shù)因在指數(shù)擴增期間，通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強弱的變化即時測定特異性產(chǎn)物的量來推斷目的基因的初始量，所以可克服終端定量存在的弊端[12]。文中采用qRT-PCR法檢測了刺五加不同生長發(fā)育時期其不同器官和不同皂苷含量組間的SS基因表達情況，并分析了其對刺五加中皂苷含量的影響情況，以期為闡明刺五加的皂苷合成機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試的刺五加分別為采自于遼寧省本溪市，吉林省穆棱市、琿春市、梅河口市、伊通滿族自治縣，黑龍江省雞西市和河北省興隆縣的3年生野生刺五加。經(jīng)河北聯(lián)合大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院邢朝斌副教授鑒定，其為五加科植物刺五加E.senticosus。

1.2 試 劑

SYBR Premix Ex TaqTM II購于寶生物工程（大連）有限公司；Taq酶、植物RNA提取試劑 盒、RevertAidTM First strand cDNA synthesis Kit(Fermentas)和dNTPs購于天根生化科技(北京)有限公司；齊墩果酸對照品（批號為110709-200505，購于中國藥品生物制品檢定所，用于測定刺五加總皂苷含量）；甲醇、香蘭素、乙醇、濃硫酸、石油醚均為國產(chǎn)分析純；市售娃哈哈純凈水。

1.3 儀 器

UV-9100紫外-可見分光光度儀（北京瑞利分析儀器公司）；KDC-16H高速臺式離心機、1 /1萬電子天平（上海亞榮儀器廠）；FW 100型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；RE-52ZZ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮儀器廠）；KQ3200DV型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Rotor gene 3000 real time PCR 儀（德國Qiagen 公司）；CHA-S型氣浴搖床（金壇市精達儀器制造廠）。

1.4 方 法

1.4.1 總RNA的提取與逆轉(zhuǎn)錄

分別在4月26日（萌芽期）、5月26日（葉片完全展開期）、6月26日（盛花期）、7月26日（果實快速生長期）、8月26日（果實成熟期）和9月26日（葉片衰老期）取葉片、葉柄、莖和根為總RNA提取材料。同時，在刺五加萌芽后，以穆棱產(chǎn)的刺五加為試材，噴施5 mmol/L茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）于葉片表面，至滴水為止，連續(xù)噴施3次，每次間隔5 d，并以蒸餾水為對照，進行平行處理。

按照植物RNA提取試劑盒說明書的要求，稱取各刺五加樣本0.1 g，提取總RNA。用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，以紫外分光光度法測定其純度和濃度。參考RevertAidTM First strand cDNA synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑的說明，取總RNA 3 μL，以O(shè)ligo(dT)18為引物，合成cDNA第一鏈，反應(yīng)總體系 20 μL。

1.4.2 引 物

根據(jù)已克隆的刺五加SS基因（HQ456918）、GAPDH（HQ184063） 基 因 的 cDNA序 列，利 用Primer premier 5.0設(shè) 計real time PCR特 異 性 引 物。GAPDH的 上 游 引 物 為 5′-GATTTGGCATTGTTGAGGG-3′，下 游 引 物 為 5′-TGCTATCGCCTATGAAGTCC-3′；SS 基因的上游引物為 5′-GACACTGTTGAGGATGACACA-3′，下游引物為 5′-GCCAAATCTTCTAACCCAGA-3′。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，PAGE純化。

1.4.3 Real time PCR反應(yīng)

以含有刺五加SS基因和GAPDH基因的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，提取高濃度的質(zhì)粒DNA，10倍梯度稀釋，共設(shè)5個梯度，用于制作各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線。Real time PCR反應(yīng)總體系為25 μL，其中，10倍稀釋的cDNA或各濃度的質(zhì)粒DNA模板1 μL，上下游引物各 1 μL，SYBR?Premix Ex TaqTMII 12.5 μL，補 dd H2O 至 25 μL。利用 Rotor gene 6 000 real time PCR儀，95 ℃預(yù)變性處理30 s后，94 ℃變性 5 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 20 s，40個循環(huán)進行PCR擴增。溶解曲線分析溫度范圍為72～95 ℃，每1 ℃讀1次，持續(xù)5 s，重復(fù)3次。

1.4.4 數(shù)據(jù)的收集與分析

運用Rotor gene 6軟件分別計算每個樣品SS基因和GAPDH基因的定量結(jié)果，以GAPDH基因的定量結(jié)果求出每個樣品總RNA加樣量的誤差，用SS基因的定量結(jié)果除以總RNA加樣量誤差得到校正后的結(jié)果。利用如下公式計算各樣本中SS基因的表達量：

相對表達量=（待測樣品SS基因初始濃度/待測樣品GAPDH基因初始濃度）/（對照樣品SS基因初始濃度/對照樣品GAPDH基因初始濃度）。

1.4.5 刺五加總皂苷含量的測定與相關(guān)性分析

參照邢朝斌等人[13-14]的方法進行測定，根據(jù)如下回歸方程計算刺五加的總皂苷含量：

再根據(jù)總皂苷含量，應(yīng)用SPSS 17.0軟件，將刺五加劃分為具有極顯著差異（P＜0.01）的高、中、低含量組，并進行顯著性檢驗和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SS基因在刺五加不同生長發(fā)育時期表達量的變化情況

自萌芽期始至葉片衰老期的整個生長期中，刺五加的SS基因均有表達，但表達量呈現(xiàn)出“低—高—低—高—低”的變化趨勢（如圖1所示）。文中各圖中的不同小寫字母代表差異顯著（P＜0.05）。由圖1可知，萌芽期（4月26日）其表達量最低，葉片完全展開后（5月26日）其表達量升高至萌芽期的1.56倍，盛花期（6月26日）SS基因的表達量達到整個生長期中的最大值，為萌芽期的3.11倍。進入果實快速生長期（7月26日）時SS基因的表達量降低至萌芽期的2.02倍，但仍顯著高于萌芽期的表達量（P＜0.05）。果實成熟期（8月26日）時，SS基因的表達量再次小幅升高至萌芽期的2.41倍。至葉片進入衰老期（9月26日）后，SS基因的表達量再次降低，但仍達到萌芽期的1.48倍。

2.2 SS基因在刺五加不同器官中表達量的變化情況

在果實成熟期（8月26日），刺五加不同器官中SS基因均有表達。其中，根中SS基因的表達量顯著高于莖、葉和葉柄中的表達量（P＜0.05），莖中的表達量最低，僅為根中的51.88%，葉片和葉柄中SS基因的表達量介于根和莖中SS基因的表達量之間，且與根和莖中表達量的差異均達到顯著水平（P＜0.05），但葉片與葉柄中的表達量間的差異未達顯著水平（如圖2所示）。

圖1 刺五加不同生長發(fā)育時期SS基因的相對表達量Fig.1 Relative expression quantity of SS gene at different growth and development stages of E. senticosus

圖2 刺五加不同器官中SS基因的相對表達量Fig.2 Relative expression quantity of SS gene in different organs of E. senticosus

2.3 MeJA對SS基因表達的影響

在整個生長期中，MeJA處理與清水處理（對照）的SS基因表達量均呈現(xiàn)出“低—高—低—高—低”的變化趨勢（如圖3所示），且相同生長發(fā)育期內(nèi)，MeJA處理組的SS基因表達量均略高于對照組的表達量，但差異未達到顯著水平。其中，在盛花期（6月26日），MeJA將SS基因的表達量提高到了對照的1.16倍，為提升的最大值。

圖3 MeJA處理的刺五加SS基因的相對表達量Fig.3 Relative expression quantity of SS gene in E. senticosus treated by MeJA

2.4 刺五加總皂苷含量的分組情況

所測刺五加樣本的總皂苷含量為0.871%～3.124%。采用SPSS 17.0軟件將30株刺五加劃分為具有極顯著差異（P＜0.01）的高含量組、中含量組和低含量組，每組10株。其中，低含量組、中含量組、高含量組的總皂苷含量分別為0.871%～1.028%、1.273%～1.532%、2.166%～3.124%。高含量組的總皂苷平均含量分別是中含量組和低含量組的1.89和2.79倍。

2.5 SS基因表達對刺五加總皂苷含量的影響

刺五加總皂苷高、中和低含量組樣本的SS基因表達量呈現(xiàn)依次降低的變化趨勢，且三者間的差異達到極顯著水平（P＜0.01）（如圖4所示）?？傇碥崭吆拷M的SS基因表達量最高，分別達到中、低含量組表達量的1.30和1.51倍。刺五加的總皂苷含量與SS基因的表達量之間呈現(xiàn)出同升同降的變化趨勢，存在著極顯著的正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。

圖4 刺五加不同總皂苷含量組的SS基因相對表達量Fig.4 Relative expression quantity of SS gene in E. senticosus with different saponin contents

3 討 論

鯊烯合酶催化生成的鯊烯是生物合成三萜皂苷類和甾醇類化合物的第一個前體物質(zhì)[3]。在煙草細胞的培養(yǎng)物中加入真菌誘導(dǎo)子后，可迅速降低其鯊烯合酶的酶活性，進而使甾醇的生物合成和積累受到顯著抑制[15]。將人參的SS基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入刺五加后，SS基因的過量表達顯著促進了甾醇和三萜皂苷類化合物的大量合成[16]，而轉(zhuǎn)SS基因的人參再生植株的三萜皂苷產(chǎn)量卻達到了對照的3倍[17]，這說明，鯊烯合酶在植物甾醇和三萜皂苷的生物合成中具有很強的調(diào)控功能。

研究中發(fā)現(xiàn)，刺五加的SS基因在其整個生長期中的表達量呈現(xiàn)出如下的變化趨勢：自萌芽期開始表達，而后逐漸上升，至盛花期表達量達到最大值，然后下降，至果實成熟期又小幅回升，葉片衰老后再次降低，即“低—高—低—高—低”的變化趨勢，這與其總皂苷積累的規(guī)律基本相符[18]。刺五加SS基因的表達量與總皂苷含量的相關(guān)性分析結(jié)果也表明，刺五加的總皂苷含量與SS基因的表達量之間呈現(xiàn)出同升同降的變化趨勢，兩者間存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），這說明鯊烯合酶在刺五加皂苷的生物合成中發(fā)揮著重要作用。對刺五加不同器官中SS基因表達量的分析結(jié)果表明，刺五加的SS基因在其根中的表達量最高，葉片次之，葉柄和莖中的較少，這與多數(shù)物種中SS基因可在各種組織和器官中進行轉(zhuǎn)錄、表達，其中在葉和根部中含量最高[6,19]的特點一致。MeJA可提高多種藥用植物中三萜類化合物生物合成關(guān)鍵酶基因的表達量，并進而提高其三萜皂苷的產(chǎn)量[20-21]，但在刺五加中MeJA處理組的總皂苷含量和SS基因的表達量雖略高于對照組，但均未達到顯著水平。這可能與本實驗中MeJA處理的材料為刺五加的植株且其僅在生長期的早期被作短期處理過，而非其他物種中常用的在懸浮培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基中加入MeJA使培養(yǎng)物長期處于MeJA的作用之下有關(guān)。

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