于 雷，于 麗，張 薇，陸麗麗

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118)

目前，酶法催化因其具有可常溫反應(yīng)、反應(yīng)速度快、催化作用專一、能夠在水相中催化等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)逐漸成為國際綠色化學(xué)發(fā)展的重要趨勢之一。酶制劑作為生物催化劑廣泛應(yīng)用在化工、醫(yī)藥和能源等產(chǎn)品的開發(fā)中[1]。酶催化劑與有機(jī)催化劑相比具有較強(qiáng)的催化能力，它能夠把一系列復(fù)雜的分子作為底物且反應(yīng)速率是非酶催化反應(yīng)速率的幾十甚至幾百倍。因此，人們構(gòu)建出越來越多的酶分子催化工藝，以替代傳統(tǒng)高能耗和高污染的化學(xué)催化工藝，滿足人們對節(jié)能環(huán)保的需求。

“Metagenome”是由Handelsman等[2]于1998年提出的一個新名詞，其定義為特定生物環(huán)境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和，主要包括細(xì)菌和真菌。自然界中的微生物是生物催化劑的一個非常重要的來源，人們利用傳統(tǒng)的方法從環(huán)境樣本中分離新型酶主要是建立在純培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，據(jù)估計通過純培養(yǎng)方法開發(fā)的環(huán)境微生物只占總量的0.1%～1%[3]。而生物環(huán)境中有多達(dá)99%以上的微生物是不可培養(yǎng)的。宏基因組是直接從環(huán)境樣本中提取總的DNA，利用合適的載體克隆至宿主細(xì)胞構(gòu)建宏基因文庫，從中篩選新的目的基因及活性物質(zhì)。此外，研究者們從一些具有極端pH值、極端溫度、低水分活度、高滲透性、高光照等極端條件的環(huán)境中分離出來具有了新型的框架及適應(yīng)此棲息環(huán)境的特殊催化性能的酶。利用宏基因組技術(shù)對環(huán)境中DNA進(jìn)行分離、歸檔和分析，以便更好地開發(fā)利用生物的多樣性，識別并了解它們的基因序列、蛋白質(zhì)編碼序列甚至重建其代謝途徑。宏基因組的研究使人們擺脫了微生物不可培養(yǎng)的限制，揭示出更多新的生物學(xué)規(guī)律，同時也為人們挖掘微生物來源的新酶及活性小分子，提供更為強(qiáng)大的技術(shù)手段。本文通過對宏基因組技術(shù)的綜述，以期其在酶制劑研發(fā)方面得到更為廣泛的應(yīng)用。同時利用宏基因組技術(shù)開發(fā)新酶為食品新產(chǎn)品研發(fā)奠定了基礎(chǔ)，為食品工業(yè)化生產(chǎn)開辟了一條新的途徑，必將推動食品行業(yè)的蓬勃發(fā)展。

1 宏基因組學(xué)概述

目前人們使用宏基因組技術(shù)手段，主要集中在兩方向的研究：一是增強(qiáng)人們對生物多樣性和環(huán)境微生物相互關(guān)系的認(rèn)識；二是挖掘出新的酶(蛋白)大分子和小分子活性物質(zhì)[4]。當(dāng)今人們使用的大多數(shù)酶是從微生物細(xì)胞中提取的。除真核生物和單細(xì)胞酵母外，原核生物是酶蛋白的主要來源。原核生物(細(xì)菌和古生菌)是地球上出現(xiàn)最早和數(shù)量最多的生命形態(tài)，經(jīng)歷了漫長的演變后為適應(yīng)惡劣的環(huán)境從而具有了很強(qiáng)的適應(yīng)特性，從中可以得到許多具有特殊催化功能的生物催化劑。但由于大多數(shù)原核生物不能夠被培養(yǎng)或暫時還沒有找到合適的培養(yǎng)底物從而使對其的開發(fā)利用受到了限制。宏基因組方法避免了一些微生物培養(yǎng)條件的限制，對不可培養(yǎng)微生物的基因進(jìn)行提取、篩選與表達(dá)，不斷擴(kuò)大自然界中基因樣本的數(shù)據(jù)空間，從中源源不斷地尋找出低同源序列的蛋白質(zhì)，為新型生物催化劑的開發(fā)及篩選提供了一個廣大的資源庫。

1.1 宏基因組DNA提取技術(shù)

宏基因組DNA提取既要盡可能地大量提取樣本的基因組，又要保持片段的完整性和純度[5]。宏基因組DNA的提取方法主要有兩種：一種是原位提取法，該方法操作簡單所獲得的DNA較完整，并能很好地代表特定生物群落的多樣性[6]。但此方法常會出現(xiàn)細(xì)胞裂解不完全或由于機(jī)械剪切力較強(qiáng)，使DNA片段過小(一般為1～5kb)等問題。另一種是異位提取法，是利用物理方法將微生物從環(huán)境樣本中分離出來，再按純培養(yǎng)細(xì)胞的處理方法裂解微生物細(xì)胞提取DNA[7]。該方法獲得的DNA雜質(zhì)少， DNA片段具有很好完整性(20～500kb)。但此方法不易提取一些細(xì)胞壁較厚的微生物DNA，并且DNA產(chǎn)率只是原位提取法的1%～10%[8]。對于酶主要來源的土壤宏基因庫來說，由于微生物與土壤粒緊密結(jié)合及腐植酸等抑制性物質(zhì)的存在，很難從自然界中獲得高分子質(zhì)量的eDNA。為此人們采用乙醇沉淀法去除土壤粒及腐植酸的干擾，使DNA析出從而得到純化的宏基因組DNA[9]。

1.2 宏基因組富集技術(shù)

全細(xì)胞的富集培養(yǎng)是利用適合的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，但由于優(yōu)勢菌群的快速生長會競爭有限的營養(yǎng)，進(jìn)而導(dǎo)致少數(shù)的“稀有”菌群的丟失。對此，人們采用先在嚴(yán)格條件下短時間處理，后改為較溫和的處理條件，在一定程度上可以克服這一局限性[8]。

穩(wěn)定同位素探針(stable-isotope probing，SIP)利用13C-DNA檢測到的高活性生物群落較小，但被標(biāo)志的DNA數(shù)量較少，利用標(biāo)準(zhǔn)的探針不易被檢測到。因此，賈仲軍[10]使用高靈敏的PCR技術(shù)，有效地檢測到大量在密度梯度離心中看不見的被標(biāo)記的DNA片段。同時，分子指紋圖譜已經(jīng)被用于判定不同浮力密度中13C-DNA的富集程度，從而獲得不同浮力密度DNA[11]。

抑制性消減雜交技術(shù)(suppression subtractive hybridization，SSH)是通過一次差減雜交使低豐度的序列(mRNA)得以高于1000倍的富集，從而有效地選擇擴(kuò)增目標(biāo)序列并抑制非目標(biāo)序列的擴(kuò)增[12]。

RT-RNA是通過減少單鏈核苷酸的降解，達(dá)到獲取完整DNA的方法。由于從環(huán)境樣本中直接提取的稀有微生物的相關(guān)DNA只占總DNA的較少比例，這會導(dǎo)致在后續(xù)的PCR操作中，優(yōu)勢微生物目標(biāo)基因偏嗜性擴(kuò)增的出現(xiàn)。可以通過微生物均一化的方法來解決這一問題，即在氯化銫梯度離心時存入嵌入劑，如雙苯甲亞胺[13]。此外，稀有物種的DNA與大量的單鏈DNA相比產(chǎn)生雙鏈核酸的速度快。因此使變性斷裂的DNA片段在嚴(yán)格條件下重新退火，可以從雙鏈核酸中分出單鏈核酸從而使稀有微生物的基因序列得以富集[14]。

1.3 宏基因組文庫構(gòu)建

常用的載體有質(zhì)粒(plasmid)、細(xì)菌人工染色載體(BAC)、柯斯黏粒(Cosmid)、福斯黏粒(Fosmid)等[15]。質(zhì)粒載體插入片段較小(＜10kb)而大片段DNA可以采用克隆效率高的Cosmid(35～45kb)、BAC(200kb)等載體[16]。同時由于外源基因的表達(dá)受宿主細(xì)胞的遺傳類型、細(xì)胞基質(zhì)、細(xì)胞的生理狀態(tài)及初級代謝產(chǎn)物的影響，人們利用穿梭載體擴(kuò)大宿主的范圍以便于促進(jìn)和提高外源基因的表達(dá)[17]。

對于質(zhì)粒型小插入片段的異源表達(dá)，應(yīng)用雙向質(zhì)粒表達(dá)載體可以明顯提高質(zhì)粒型小文庫中DNA的表達(dá)水平，進(jìn)而提高目標(biāo)基因產(chǎn)物篩選的命中效率[18]。另外，對于原位裂解方式獲得的eDNA片段，為避免對其攜帶基因的再次破壞，末端補(bǔ)平或T-A連接的方式替代使用限制性內(nèi)切酶方法可以提高宏基因組文庫的庫容[19]。

大腸桿菌由于生長迅速、遺傳背景清晰并且遺傳操作容易成為克隆外源基因的首選宿主。但是要使異源DNA插入片段成功地轉(zhuǎn)錄，要求宿主必須能夠識別內(nèi)在的啟動子。而不良的表達(dá)會導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯誤的折疊或不溶。大腸桿菌因具有很少氨基酸的密碼子進(jìn)而導(dǎo)致氨基酸不能正確排列成肽鏈或者被截斷。為此人們使用了噬菌體載體使具有特定活性的酶能夠在噬菌體菌苔上直接進(jìn)行篩選[20]，或利用穿梭載體替代目標(biāo)基因在宿主表達(dá)的DNA環(huán)境[21]。

1.4 宏基因組篩選

序列驅(qū)動的篩選方法(sequence-driven screening)需要根據(jù)已知基因或基因表達(dá)產(chǎn)物的保守序列設(shè)計探針和引物。這一要求導(dǎo)致許多新型基因不易被發(fā)現(xiàn)，甚至使2個共同進(jìn)化的功能相似的基因也很難用“家族特異性”引物區(qū)分開來。由于對序列信息的依賴基因測序技術(shù)成為了序列驅(qū)動篩選的關(guān)鍵技術(shù)。當(dāng)代最新的測序方法是由Pacific Biosciences公司推出的單分子實時DNA測序。第三代測序技術(shù)實現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度及自身的延續(xù)性，1s可以測序超過10個堿基，酶法測序速度是化學(xué)法測序的2萬倍，同時它的精度非常高，達(dá)到99.9999%[22]。而序列驅(qū)動的篩選方法一般只能獲取功能基因的片段得不到基因的全部序列[23]。目前，人們利用基因步移法(gene walking)對目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，具體做法是利用擴(kuò)增子作為標(biāo)記探針去識別傳統(tǒng)宏基因組文庫中假定基因或利用PCR技術(shù)恢復(fù)基因上游或下游空白序列從而得到基因的全部序列[18]，生秀杰等[24]利用基因步移法成功克隆出小鼠Doc-1R基因組序列。

功能篩選(function-driven screening)不依賴基因序列信息，篩選到的基因與數(shù)據(jù)庫中已知的基因往往具有較低的同源度，適用于大片段DNA文庫篩選。功能篩選的方法有兩種：一種是在選擇培養(yǎng)基上表型特征進(jìn)行篩選。另一種方法是基于異源基因的宿主菌株與其突變體，在選擇性條件下依據(jù)功能互補(bǔ)生長的特性進(jìn)行的[25]。此方法往往需要目的基因在宿主內(nèi)能夠成功地表達(dá)并產(chǎn)生酶蛋白。但在篩選時細(xì)胞內(nèi)潛脂類酶的活性能夠降低篩選的靈敏性，從而降低篩選的產(chǎn)率。已經(jīng)證實使用細(xì)胞裂解劑能使酶分子從細(xì)胞內(nèi)釋放出來并成功表達(dá)從而保持其本體構(gòu)象[26]。

底物誘導(dǎo)基因表達(dá)法(SIGEX)是利用相關(guān)底物誘導(dǎo)基因編碼催化活性基因表達(dá)為基礎(chǔ)的篩選方法。該方法使用一種gfp操縱子捕獲載體，載體基因下游具有一個報告基因插入的克隆位點(diǎn)。插入基因表達(dá)時可以從報告基因衍生的信號被頻繁地識別出來，并在液體培養(yǎng)基中通過熒光激活細(xì)胞分離器(FACS)篩選陽性克隆。這種方法為高通量篩選提供了保障，但FACS對進(jìn)樣設(shè)備的要求很高，同時其目的基因的結(jié)構(gòu)性和適應(yīng)性也十分敏感[27]。

2 宏基因組技術(shù)在新酶開發(fā)中的應(yīng)用

利用宏觀基因組技術(shù)開發(fā)的新型酶蛋白大多具有新的序列，顯示了與已知的基因產(chǎn)品的非相似性，進(jìn)而形成近親關(guān)系的深枝譜系。Jaeger等[28]利用大腸桿菌為宿主從8個蛋白質(zhì)家族中篩選到41個編碼新型蛋白質(zhì)的基因，包括二氫葉酸還原酶及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等。其中有些來自于同一家族的蛋白質(zhì)具有不同的抗性序列，這些抗生素耐藥性蛋白序列揭示了不同變種所具有的蛋白功能。而這一系列新酶有效地推動了醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展。此外，多功能酶也作為重要的生物催化劑廣泛應(yīng)用于食品、化學(xué)和生物燃料行業(yè)[5]。諸如此類的酶有從沿海海水宏基因組中尋找到的幾丁質(zhì)酶[29]、土壤宏基因組中的乳酸解聚酶[30]、牛瘤胃內(nèi)容物宏基因組中的β-葡萄糖苷酶等[31]。目前利用宏基因組技術(shù)開發(fā)酶的數(shù)量正在成指數(shù)級增長，這充分表明該技術(shù)對酶基因的篩選及修飾具有很高的使用價值[32]。

Ferrer等[33]在深海高鹽度環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了5種酯酶，有2種與已知酯酶有顯著同源性。其結(jié)合了3個催化活性中心直接調(diào)節(jié)水解活性，是一種適應(yīng)三級到四級結(jié)構(gòu)之間的催化三聯(lián)體。同時建立了奶牛瘤胃宏基因文庫，利用噬菌體作為載體進(jìn)行活性篩選。證實有22種克隆具有明顯的水解活性(12個酯酶、9個內(nèi)切β-1,4葡聚糖酶及纖維糊精酶)，其中36%具有完全新的序列或與已知酯水解酶類及糖基水解酶類低同源性的深支親緣譜系[34]。這些酯酶能夠有效地水解丙酮縮甘油酸產(chǎn)生手性結(jié)構(gòu)。并且其具有很強(qiáng)的催化水解脂肪、油及一系列羧基脂的能力，在食品工業(yè)被用在增加食品的風(fēng)味、生產(chǎn)風(fēng)味添加劑、去除污染物以及脂質(zhì)廢物合成結(jié)構(gòu)性甘油三酯，同時其能夠使白酒更純香、食醋更具風(fēng)味[35]。

宏基因組在食品工業(yè)中開發(fā)的另外一組較有吸引力的酶是碳水化合物水解酶，如淀粉酶類、葡糖淀粉酶、纖維素酶和幾丁質(zhì)酶等。Brennan等[36]從白蟻的腸道和鱗翅類動物的嘴中分離微生物的DNA建立基因文庫，從中篩選到了木聚糖酶，該酶能催化水解各種與β-1,4-相關(guān)的低聚木糖及高分子底物，并產(chǎn)生獨(dú)特的水解產(chǎn)物。在釀酒過程中其能夠提高酒精產(chǎn)率、澄清酒液，參與面包的制作及貯藏，在果汁制作中對果蔬細(xì)胞壁的去除及對產(chǎn)率的提高發(fā)揮著重要作用。磷酸吡哆醛作為VB6的主體藥物也被人們不斷加以重視。Tirawongsaroj等[37]從泰國溫泉宏基因文庫中利用功能篩選方法，找到了具有patatin基因的耐高溫脂肪水解酶磷酸吡哆醛。其在pH7～9，50～75℃范圍內(nèi)展現(xiàn)了較大的活性，且在70℃時活性最高并可以保持穩(wěn)定至少120min。

宏基因組技術(shù)作為新酶開發(fā)有利的工具，其開發(fā)的酶的數(shù)量正在穩(wěn)定上升并且很快將超過利用傳統(tǒng)方法分離的酶。宏基因組技術(shù)分離的典型的酶還有β-葡萄糖苷酶、脂肪酶、多糖修飾酶(包括纖維素、α-淀粉酶、木聚糖酶、1,4-葡聚糖分支酶和果膠裂解酶)、蛋白酶、氧化還原酶、脫氫酶和參與維生素生物合成的酶等[38]。Duan等[39]從水牛瘤胃宏基因文庫中篩選到13個重組纖維素酶的克隆體。其中有2個克隆體具有降解多糖的基因，并且這些酶在較寬的pH值范圍內(nèi)具有很好的活性。因此，在酒精生產(chǎn)過程中添加纖維素酶可以增加原料的利用率，提高酒精的質(zhì)量。此外，β-葡萄糖苷酶能夠?qū)⑺?、蔬菜及茶中的風(fēng)味前體物質(zhì)水解為濃郁的天然香氣物質(zhì)；在釀酒及果汁加工過程中能增加風(fēng)味物質(zhì)，使杏仁、青梅果等食品脫苦。所以β-葡萄糖苷酶被廣泛應(yīng)用于飲料加工行業(yè)。鄭艷等[40]利用畢赤酵母作為宿主菌通過序列篩選的方法使疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶得到了高效的表達(dá)。姜智賢等[41]利用這種酶進(jìn)行酶促酯交換反應(yīng)合成代可可脂。這種代可可脂具有與進(jìn)口代可可脂相同的化學(xué)性質(zhì)，口感與天然可可脂幾乎沒有差別，并且降低了反式脂肪酸的含量。多糖降解酶能夠降解多糖的糖苷鍵，使新形成的非還原端形成雙鍵。在食品加工過程中多糖降解酶被用于分析多糖結(jié)構(gòu)，改善多糖物理學(xué)性質(zhì)。這些酶在食品工業(yè)中為新產(chǎn)品的研發(fā)及生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)，為食品行業(yè)的蓬勃發(fā)展提供了可能。

3 結(jié) 語

環(huán)境微生物總體是一個巨大的基因資源庫，人們利用現(xiàn)有技術(shù)僅僅能夠?qū)ζ渲幸恍〔糠诌M(jìn)行探索，而宏基因組技術(shù)則可揭示環(huán)境中生物的多樣性及潛在生物催化劑。宏基因組技術(shù)跨越了傳統(tǒng)依靠微生物培養(yǎng)進(jìn)行開發(fā)和探索的限制，直接從宏基因文庫中對DNA進(jìn)行克隆和篩選，使不可培養(yǎng)微生物的開發(fā)成為了可能?，F(xiàn)已利用宏基因組技術(shù)從文庫中開發(fā)出許多新型的酶制劑。這些酶制劑表現(xiàn)出了特有的催化性質(zhì)，能夠被廣泛地應(yīng)用于食品工業(yè)、醫(yī)藥業(yè)、環(huán)境治理等領(lǐng)域。雖然宏基基因組技術(shù)已經(jīng)取得令人矚目的成績，但作為一種新興的技術(shù)手段，仍需科研工作者對其進(jìn)行不懈地深入發(fā)展和廣泛應(yīng)用，使其能夠更為有效地用于探索新的微生物資源。

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