蔡德培 喬麗麗 鄭力行

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院 上海 201102；2.復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室 上海 200032)

兒童性發(fā)育異常，特別是性早熟的發(fā)病率近年來(lái)顯著增高，已成為最常見(jiàn)的小兒內(nèi)分泌疾病之一。流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，上海地區(qū)目前兒童性早熟患病率大約為1 000/10萬(wàn)，男女比例為1 ∶ 5[1]。近年來(lái)國(guó)外有大量文獻(xiàn)報(bào)告顯示，洗滌劑、農(nóng)藥及塑料工業(yè)等向環(huán)境排放的物質(zhì)及其分解產(chǎn)物，可以在自然界產(chǎn)生一系列的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（Environmental endocrine disruptors，EEDs）。當(dāng)EEDs進(jìn)入機(jī)體后，可以干擾內(nèi)分泌激素的合成、釋放、轉(zhuǎn)運(yùn)、與受體結(jié)合、代謝等途徑，從而影響內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能，破壞機(jī)體內(nèi)環(huán)境的協(xié)調(diào)和穩(wěn)定。這些物質(zhì)大多具有擬雌激素活性，如果進(jìn)入兒童體內(nèi)，與靶器官上的雌激素受體結(jié)合，將引致生殖器官及骨骼的提早發(fā)育，有可能成為性早熟的致病因素之一[2]。我們?cè)鴻z測(cè)出性早熟患兒及正常兒童血清中的3種有代表性的EEDs：洗滌劑降解產(chǎn)物—壬基酚（4-NP）、有機(jī)氯農(nóng)藥DDT的代謝產(chǎn)物（P，P’-DDE）和塑料增塑劑—鄰苯二甲酸二乙基己酯（DEHP）的含量，發(fā)現(xiàn)當(dāng)前的正常兒童已較普遍地暴露于EEDs，特別是受到當(dāng)年大量施放的有機(jī)氯農(nóng)藥DDT所造成的殘毒影響更為明顯，而性早熟患兒暴露于EEDs的程度則還要嚴(yán)重得多[3]。鑒于我們的生存環(huán)境中常見(jiàn)的EEDs多達(dá)數(shù)十種，本文選擇了另幾種有代表性的EEDs：洗滌劑降解產(chǎn)物—辛基酚（OP）、合成樹(shù)脂原料—雙酚A (BPA)和塑料增塑劑—鄰苯二甲酸二丁酯（DBP），檢測(cè)其在性早熟患兒及正常兒童血清中的含量，并同時(shí)測(cè)定性早熟患兒靶器官的發(fā)育指標(biāo)，包括子宮、卵巢體積及血清雌二醇（E2）水平，通過(guò)患兒血清中EEDs的含量與上述指標(biāo)間的相關(guān)性分析，進(jìn)一步探討EEDs暴露與性早熟發(fā)病之間的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn)

收集2005年3月至2005年9月在復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院性早熟?？崎T(mén)診就診的初診患兒，性早熟的診斷標(biāo)準(zhǔn)按《性早熟及青春期延遲》[1]。共收集性早熟女孩110例，起病年齡為6.0～8.3歲，初診年齡6.1～11.3歲。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

凡由中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)器質(zhì)性病變所致的性早熟均被排除在外。

1.1.3 對(duì)照組

選取年齡與性早熟組相匹配的正常女孩作為對(duì)照，共100例，年齡6.5～11.2歲。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 OP、BPA高效液相色譜檢測(cè)

1）樣品采集及預(yù)處理 每例采集血清2 ml，-80℃凍存待測(cè)。

（1） OP的樣品預(yù)處理 取1 ml血清，加入5 ml正己烷，旋渦混勻5 min，取出上層有機(jī)層正己烷，50℃水浴中用空氣吹干，用甲醇飽和的正已烷定容至0.1 ml后取上清液20 μL進(jìn)樣。

（2）BPA的樣品預(yù)處理 取0.5 ml血清，加入100μl的0.01 mol/L磷酸緩沖液，20 μl β-葡萄糖酸酐酶，37℃水浴3 h，冷卻后先后用3 ml及2 ml乙醚-正己烷（1∶1）渦旋混勻后各2 min進(jìn)行萃取，合并兩次萃取的有機(jī)層，置于40 ℃水浴中用氮?dú)獯蹈桑?0 μl 40%的乙腈溶解后進(jìn)樣。

（3）避免污染 為避免洗滌劑污染，實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿均用重鉻酸鉀濃硫酸溶液浸泡過(guò)夜，清洗烘干，使用前再用正己烷或乙醇淋洗兩次。

2）高效液相色譜分析 采用HP1100高效液相色譜儀檢測(cè)

（1）OP的色譜條件 采用Inertsil ODS-3 4.6 mm×250 mm，5 μm色譜柱（日本GL公司）；熒光檢測(cè)器（激發(fā)波長(zhǎng)為275 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為312 nm）柱溫為40 ℃，流動(dòng)相為甲醇∶水∶三氟乙酸（1000∶50∶1），流速為 1 ml/min，進(jìn)樣為 20 μl。

（2）BPA的色譜條件 Inertsil ODS-3 4.6 mm×250 mm，5 μm色譜柱（日本GL公司）；流動(dòng)相為乙晴∶水∶四氫呋喃（40∶60∶3）；檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)為227 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為310 nm；流速為1 ml/min；柱溫為40 ℃。整個(gè)色譜時(shí)間為25 min，進(jìn)樣為20 μl。

（3）定性分析 用OP，BPA標(biāo)樣測(cè)定其保留時(shí)間，樣品的定性分析采用與標(biāo)樣的保留時(shí)間相對(duì)照的方法進(jìn)行。

（4）定量分析 樣品處理后進(jìn)行色譜分析，所得的峰面積與樣品的工作曲線相比較，通過(guò)計(jì)算得出樣品中含該種物質(zhì)的實(shí)際濃度。

3）標(biāo)準(zhǔn)曲線和工作曲線

配制 20、10、50、100、500、1000 μg/ml的 6 個(gè)含量的OP標(biāo)準(zhǔn)品，作濃度—峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線，OP的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=768.78X+20.817，r=0.998 0；OP的工作曲線Y=752.83X+21.32，r=0.997 6。

取不同體積BPA標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，用40%乙腈稀釋成濃 度 分 別 為 0、20、100、500、1 000、2 500 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到BPA的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=654.67X+21.67，r=0.998 2；取0.5 ml不含BPA的混合血清，分別加入濃度為 0、20、100、500、1 000 μg/ml的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物、2 500 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液各50 μl，用40%的乙腈充分溶解，進(jìn)樣20 μl，得到BPA的工作曲線Y=638.15 X+31.35，r=0.991 3。

4）回收率和精密度見(jiàn)表1。

表1 OP、BPA的回收率與精密度

1.2.2 DBP氣相色譜分析

1）樣品采集及預(yù)處理

每例采集血清2 ml，-80℃凍存待測(cè)。

（1）樣品預(yù)處理 取1 ml血清，加入5 ml正己烷，旋渦振蕩器上振蕩5～10 min，3000 r/min離心5 min，取上層正己烷層，用空氣泵吹干，用甲醇飽和的正己烷定容至 200 μl，后取上清液 20 μl進(jìn)樣。

（2）避免污染 為避免塑料制品的增塑劑對(duì)測(cè)定的干擾，全部實(shí)驗(yàn)均采用玻璃器皿。

2）氣相色譜分析

采用AL3000氣相色譜儀檢測(cè)。

（1）DBP的色譜條件 美國(guó)Sigma公司SPB-1氣相毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm ×0.25 μm；柱溫40℃(2.00 min)～15℃/ min～180℃/ min；不分流進(jìn)樣；載氣N2，流速1.5 ml/min；進(jìn)樣品溫度250℃；氫火焰離子化檢測(cè)器FID，檢測(cè)器溫度250 ℃，樣品保留時(shí)間為14.28 min。

（2）定性分析 用DBP標(biāo)樣測(cè)定其保留時(shí)間，樣品的定性分析采用與標(biāo)樣的保留時(shí)間相對(duì)照的方法進(jìn)行。

（3）定量分析 樣品處理后進(jìn)行色譜分析，所得的峰面積與樣品的工作曲線相比較，通過(guò)計(jì)算得出樣品中含該種物質(zhì)的實(shí)際濃度。

3）標(biāo)準(zhǔn)曲線和工作曲線

配制0.3、0.6、6、12、18 μg/L 5個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，做濃度—峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.04X-0.01，r=0.992。

以血清為空白，分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)得的峰面積減去空白值，繪制濃度—峰面積工作曲線，工作曲線：Y=0.04X+0.02，r=0.983 1。

4）回收率和精密度見(jiàn)表2。

表2 DBP的精密度與回收率

1.2.3 子宮、卵巢體積測(cè)定

以Hitachi EUB 40型二維超聲診斷儀測(cè)量子宮體和卵巢的長(zhǎng)、寬、厚，按（π/6×長(zhǎng)×寬×厚) cm3公式分別計(jì)算子宮體積和兩側(cè)卵巢的體積。

1.2.4 血清 E2測(cè)定

采用放射免疫分析法測(cè)定血清E2含量，試劑盒由美國(guó)DPC公司提供。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，分別對(duì)相應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行x2檢驗(yàn)、對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換、Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 性早熟患兒及正常兒童血清中OP、BPA和DBP的含量

5.0%的正常兒童血清中檢測(cè)出OP，33.6%的性早熟患兒血清中檢測(cè)出OP；2.0%的正常兒童血清中檢測(cè)出BPA，40.9%的性早熟患兒血清中檢測(cè)出BPA；4.0%的正常兒童血清中檢測(cè)出DBP，27.3%的性早熟患兒血清中檢測(cè)出DBP。性早熟患兒的血清中OP、BPA及DBP含量均顯著高于正常兒童（P＜0.001，表3）。

表3 性早熟女孩及正常兒童血清中OP、BPA、DBP的含量 (μg/L)

2.2 性早熟患兒及正常兒童血清中OP、BPA及DBP含量的分布情況

兩組血清OP、BPA及DBP含量增高人數(shù)的構(gòu)成比，性早熟患兒明顯高于正常兒童，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4）。

表4 性早熟患兒及正常兒童血清中OP、BPA及DBP含量分布 n(%)

2.3 性早熟患兒及正常兒童子宮、卵巢體積及血清雌二醇含量

性早熟患兒的子宮、卵巢體積及血清雌二醇含量均數(shù)均高于正常兒童（表5）。

2.4 性早熟患兒血清EEDs含量與子宮卵巢體積、血清E2含量的相關(guān)性分析

患兒血清OP、BPA、DBP的含量與其子宮體積均呈顯著正相關(guān)，血清OP、DBP的含量與其卵巢體積也均呈顯著正相關(guān)，即血清EEDs的含量越高，生殖器官的病變程度也越嚴(yán)重（表6）。

表5 性早熟患兒和正常兒童子宮體積、卵巢體積、血清E2含量

表6 性早熟患兒血清中EEDs含量及與子宮和卵巢體積、血清E2含量的相關(guān)性分析

3 討論

EEDs是指環(huán)境中存在的能夠干擾機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)諸環(huán)節(jié)并導(dǎo)致異常效應(yīng)的物質(zhì)。EEDs可影響天然激素的合成、分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)，并與激素受體結(jié)合，可產(chǎn)生擬雌激素活性或抗雄激素活性，從而可改變?nèi)祟惡鸵吧鷦?dòng)物內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能，導(dǎo)致生殖、發(fā)育和行為異常[4-5]。近年來(lái)國(guó)外有大量文獻(xiàn)報(bào)告顯示，洗滌劑、農(nóng)藥及塑料工業(yè)等向環(huán)境排放的物質(zhì)及其分解產(chǎn)物，可在自然界產(chǎn)生一系列的EEDs。

這些物質(zhì)具有一些共同的生物學(xué)特點(diǎn)，例如在環(huán)境中化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期存在；大多脂溶性強(qiáng)且易被機(jī)體吸收，但不易被生物降解和排出，并可通過(guò)食物鏈在生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行生物富集蓄積。EEDs可經(jīng)某些途徑，包括污染的水源、食物或經(jīng)皮膚被兒童攝入后吸收。本研究結(jié)果顯示，作為對(duì)照組的正常兒童，有5.0%的血清中檢測(cè)到OP，2.0%的血清中檢測(cè)到BPA，4.0%的血清中檢測(cè)到DBP，說(shuō)明當(dāng)前正常兒童已有一部分暴露于EEDs。

EEDs大多為小分子物質(zhì)，他們雖然在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與雌激素有所不同，但同樣可以與靶器官上的ER結(jié)合。ER上具有多個(gè)配體結(jié)合部位，某些部位可與天然雌激素結(jié)合，而其他部位則可與多種EEDs結(jié)合。當(dāng)EEDs與ER結(jié)合后，可以相互之間、也可以與天然雌激素間發(fā)揮協(xié)同作用，激發(fā)雌激素效應(yīng)的產(chǎn)生。處于發(fā)育階段的靶器官，對(duì)EEDs的作用則更為敏感，如果受到較明顯的EEDs污染或受到多種EEDs的污染，則可引起靶器官的顯著病變。青春期兒童正處于發(fā)育階段，對(duì)EEDS遠(yuǎn)較成人敏感，很低的劑量就可能對(duì)下丘腦—垂體—性腺軸造成不良影響。本研究結(jié)果顯示，33.6%的性早熟患兒血清中檢測(cè)到OP，40.9%血清中檢測(cè)到BPA，27.3%血清中檢測(cè)到DBP，且從EEDs的血清含量分布情況來(lái)分析，性早熟患兒EEDs的暴露程度比正常對(duì)照組兒童嚴(yán)重得多，說(shuō)明EEDs與兒童性早熟的發(fā)病有密切關(guān)系。

OP是雌激素活性最強(qiáng)的烷基酚類物質(zhì)的降解物。有研究報(bào)道未成年雌鼠暴露于OP可使成年時(shí)子宮重量增加，BPA能從塑料制品中擴(kuò)散出來(lái)引起環(huán)境和食物的污染。1993年Krishnan等首次發(fā)現(xiàn)高壓滅菌時(shí)，BPA從碳酸酯塑料瓶中擴(kuò)散出來(lái)，并具有雌激素活性。后來(lái)，又有人發(fā)現(xiàn)食品包裝容器或塑料薄膜中的BPA污染了食品或飲料。DBP作為塑料的增塑劑，被廣泛應(yīng)用于塑料制品的生產(chǎn)加工中。隨著使用的增多和時(shí)間的推移，特別是作為垃圾廢棄和焚燒，可滲出至環(huán)境中，造成污染。DBP可通過(guò)食物鏈在生態(tài)系統(tǒng)中，特別是在水生生物體內(nèi)進(jìn)行富集和濃縮，并可達(dá)到相當(dāng)高的濃度。Puerto Rico大學(xué)的Washam在2000年測(cè)定了波多黎各島41例乳房早發(fā)育女孩與35例正常女孩的血液樣品，發(fā)現(xiàn)乳房早發(fā)育女孩血清DBP的濃度明顯高于對(duì)照組，68.0%乳房早發(fā)育女孩的血液樣品中可以檢測(cè)出DBP，與之相比，只有1例正常女孩血液中可以檢測(cè)出DBP，排除其它干擾因素，推測(cè)鄰苯二甲酸酯類制品可能與當(dāng)?shù)嘏⑷榉康脑绨l(fā)育有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示患兒血清OP、BPA、DBP、DEHP的含量與其子宮、體積均呈顯著正相關(guān)，血清OP、DBP、DEHP的含量與卵巢體積也均呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明EEDs對(duì)靶器官病變有顯著作用，是兒童性早熟的重要致病因素之一。

總之，從本研究的上述結(jié)果可初步得出下列結(jié)論：當(dāng)前正常兒童已有一部分暴露于EEDs，性早熟患兒EEDs暴露程度比正常兒童嚴(yán)重得多；EEDs的暴露與兒童性早熟的發(fā)病有著密切關(guān)系，是其重要的致病因素之一。

我們的研究結(jié)果應(yīng)當(dāng)引起政府有關(guān)方面的重視，可作為有關(guān)部門(mén)制定及完善相關(guān)產(chǎn)業(yè)和環(huán)保方面政策法規(guī)的客觀依據(jù)，并希望能夠盡快制定出適合國(guó)情的防治方案，以避免更多兒童受到EEDs的不良影響。

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