國立東，楊麗杰，霍貴成

1(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱，150030)2(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱，150040)

心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)已成為我國人群的首要死因［1］，也是全球范圍內(nèi)威脅人類健康的主要疾病，其中死亡率最高的是冠心病(coronary heart disease，CHD)［2］，而膽固醇水平升高是導(dǎo)致冠心病的最重要危險因素。血清總膽固醇每降低1%，發(fā)生冠心病的危險性可減少2% ～3%［3］。因此，降低血清膽固醇水平已成為預(yù)防和治療冠心病的首要目標。

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)大量棲居于人體腸道內(nèi)，作為腸道菌群主要的微生物群落，對宿主健康具有一定的促進作用［4］。隨著研究的深入，近年來發(fā)現(xiàn)人體腸道內(nèi)的微生物群落與慢性疾病的發(fā)生有關(guān)［5］，并提出“慢性病的腸源性學(xué)說”［6］。因此，作為腸道內(nèi)有益菌的乳酸菌愈加受到食品及醫(yī)藥工作者的關(guān)注。降低血清膽固醇水平作為乳酸菌主要益生功能之一，已得到大量體外和體內(nèi)(動物和人體)實驗證實［7－11］，研究人員基于生長培養(yǎng)基、細胞模型和動物模型已相繼提出多種假說論證其降膽固醇的可能機制，但作用機制尚不明晰，尤其是體內(nèi)降膽固醇機制。文中就半個世紀以來全球?qū)W者關(guān)于乳酸菌降膽固醇機制提出的各種假說進行總結(jié)，并對其存在的問題進行了分析與展望。

1 生長培養(yǎng)基中降膽固醇的機制

乳酸菌降膽固醇機制最早就是基于其生長培養(yǎng)基而提出，主要包括:共沉淀作用、乳酸菌吸收或吸附膽固醇、乳酸菌細胞積累膽酸、抑制膽固醇乳化膠束形成、膽固醇氧化酶和膽固醇還原酶活性等。

1.1 共沉淀作用

共沉淀理論是較早提出的機理假說之一。膽固醇和結(jié)合型膽酸共存的培養(yǎng)基中，乳酸菌發(fā)酵液pH值維持在6.0時膽固醇穩(wěn)定存在，pH值低于5.5時體系中膽固醇會沉淀下來［12］，且伴隨游離膽酸一起沉淀，即所謂的“共沉淀”現(xiàn)象。游離膽酸的產(chǎn)生是由于乳酸菌具有膽酸鹽水解酶(bile salt hydrolase，BSH，EC 3.5.1.24)活性，水解結(jié)合型膽酸而生成［7］。此外，若采用水溶性膽固醇，即便pH值低至4.0時也僅有很少膽固醇沉淀下來，因此共沉淀現(xiàn)象的發(fā)生與膽固醇以膠束還是非膠束形式添加到體系中有關(guān)［13］。膽酸鹽有利于維持膽固醇膠束的穩(wěn)定性，游離膽酸鹽的pKa值接近于5.1［14］，酸性條件下會解離并破壞體系中膽固醇膠束穩(wěn)定性，繼而發(fā)生共沉淀［12］，因此共沉淀現(xiàn)象的發(fā)生不僅依賴于膽固醇膠束的存在也要依賴于環(huán)境pH值的高低。然而，人體腸道內(nèi)pH值在中性范圍［15］，雖有研究發(fā)現(xiàn)鈣離子存在時游離膽酸鹽于偏酸性生理條件下也可能發(fā)生沉淀［16］，但這種共沉淀效應(yīng)在人體內(nèi)到底能發(fā)揮多大作用，仍有待于進一步澄清。

1.2 乳酸菌吸收或吸附膽固醇

乳酸菌可以通過細胞壁、細胞膜或細胞質(zhì)不同程度地吸收或吸附膽固醇。生長在含膽固醇培養(yǎng)基中的乳酸菌，在不控制pH值和控制pH值為6.0兩種情況下，從分離的乳酸菌細胞膜中檢測到了膽固醇的存在［17］。此外，在1株生長于含膽固醇和結(jié)合型膽酸鹽培養(yǎng)基中的食淀粉乳桿菌(Lactobacillus amylovorus)細胞內(nèi)檢測到了50%以上的膽固醇，同時膽固醇總量未變，也就是說膽固醇未被乳酸菌降解［18］。近年，研究人員通過掃描電鏡直觀地觀察到了乳酸菌吸附膽固醇到細胞壁上的現(xiàn)象［19］，其中細胞壁肽聚糖的化學(xué)與結(jié)構(gòu)特性可以影響膽固醇的吸附特性，確切地說是肽聚糖含有的氨基酸具有結(jié)合膽固醇的能力［20］。

乳酸菌細胞壁吸附膽固醇是一種物理現(xiàn)象［20］，而細胞膜吸收的膽固醇在磷脂尾部、上端磷脂以及磷脂雙分子層的極性頭部區(qū)域均有出現(xiàn)，膽固醇在不同區(qū)域的富集可能降低乳酸菌細胞膜的通透性與流動性，這也更好地解釋了為何生長在含膽固醇培養(yǎng)基中的乳酸菌細胞對超聲波或酶裂解作用展現(xiàn)出更強的抵抗力［21］。然而，膽固醇被乳酸菌吸收到細胞內(nèi)其生物學(xué)意義何在至今尚不清楚。

1.3 其他機理

在許多乳桿菌和雙歧桿菌屬菌株中，均發(fā)現(xiàn)乳酸菌細胞內(nèi)能積累膽酸(cholic acid)，膽酸的積累具有自發(fā)性，其驅(qū)動力是跨膜質(zhì)子梯度(ΔpH)，降低胞外pH值可增加積累量，因此可通過腸道微生物產(chǎn)生的短鏈脂肪酸或乳酸降低腸道pH值，從而可能增強乳桿菌在體內(nèi)對膽酸的積累［22－23］，為了補償肝腸循環(huán)過程中失去的膽酸量，膽固醇會進一步分解生成新的膽酸，從而達到降低膽固醇的目的。膠束形式存在的膽固醇有利于腸道的吸收［24］，Lye 等［19］通過體外研究發(fā)現(xiàn)供試乳桿菌能抑制膽固醇膠束的形成，從而推斷其在體內(nèi)也可能通過這樣的方式來降低腸道對膽固醇的吸收。此外，乳桿菌和雙歧桿菌等普遍缺乏膽固醇氧化酶活性，然而1株瑞士乳桿菌(L.helveticus)細胞內(nèi)與細胞外均能分泌膽固醇氧化酶，同時在培養(yǎng)基中也檢測到了膽固醇氧化產(chǎn)物1，4-雄烯二酮(ADD)和雄甾-4-烯-3，17-雙酮(AD)的存在［25］。胞內(nèi)膽固醇氧化酶活性的存在，似乎可以解釋乳酸菌吸收膽固醇到細胞內(nèi)的生物學(xué)意義，但缺乏直接證據(jù)。Lye等［21］研究發(fā)現(xiàn)11株乳桿菌屬和雙歧桿菌屬菌株胞內(nèi)和胞外均可分泌膽固醇還原酶，菌株通過吸收膽固醇到細胞膜上并利用產(chǎn)生的膽固醇還原酶將膽固醇轉(zhuǎn)化為糞甾醇，從而降低培養(yǎng)基中膽固醇含量，這為乳酸菌細胞膜吸收膽固醇的生物學(xué)意義提供了一種可能解釋。

2 基于細胞模型提出的降膽固醇機制

機體內(nèi)膽固醇水平高低主要取決于膽固醇的吸收和膽固醇的合成與分解代謝。膽固醇的吸收在腸道內(nèi)進行，而膽固醇的合成與分解則在肝臟內(nèi)完成。因此，腸細胞和肝細胞模型成為研究乳酸菌對膽固醇代謝影響的首選靶標。

2.1 影響腸細胞膽固醇吸收相關(guān)蛋白的表達

目前，人結(jié)腸腺癌細胞系Caco-2細胞模型由于結(jié)構(gòu)和功能類似于分化的小腸上皮細胞，具有微絨毛等結(jié)構(gòu)，并含有與小腸刷狀緣上皮相關(guān)的酶系，已廣泛用作研究腸細胞功能的模型，包括膽固醇吸收。

2.1.1 下調(diào)腸細胞NPC1L1的表達

Niemann-Pick C1 Like 1(NPC1L1)作為腸道膽固醇吸收的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運蛋白［26］，已成為醫(yī)藥工作者篩選降低膽固醇吸收藥物的靶蛋白［27］。

以Caco-2為腸細胞模型，通過體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)ATCC 4356能抑制Caco-2細胞對膽固醇的吸收，而這種作用是通過下調(diào)NPC1L1蛋白表達來完成［9］，同時發(fā)現(xiàn)該菌株是通過肝臟X受體(LXR)介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑來抑制NPC1L1蛋白表達的，LXR是一種核受體，能調(diào)控細胞固醇代謝的許多關(guān)鍵基因［28］。為了進一步明確L.acidophilus ATCC 4356的作用機理，研究人員發(fā)現(xiàn)該菌株的熱致死細胞并不能抑制NPC1L1表達，由此排除細胞壁組分作用的可能性。通過對菌株培養(yǎng)上清液(CS)、熱失活CS、菌株與細胞作用后的條件培養(yǎng)基(CM)及熱失活CM不同處理結(jié)果的比較分析，發(fā)現(xiàn)抑制NPC1L1表達的物質(zhì)是來自于L.acidophilus ATCC 4356自身產(chǎn)生的可溶性因子，且這種可溶性因子的產(chǎn)生并不依賴于菌株與細胞間的接觸，但起作用的可溶性因子具體為何種化合物尚不清楚。隨后，這種作用機理在其他種屬乳酸菌中也得到了證實［29］，分離于Maasai發(fā)酵乳的鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)BFE5264和源自韓國泡菜的植物乳桿菌(L.plantarum)NR74，兩菌種的活細胞均可通過抑制NPC1L1表達來降低腸細胞膽固醇吸收，但不同的是，這2株菌的抑制作用可能與細菌細胞壁組分有關(guān)，因為NPC1L1蛋白和mRNA的表達水平并不受2株乳酸菌活細胞代謝物的影響，而熱致死細胞和細胞壁提取物均能不同程度地降低NPC1L1的表達。

2.1.2 上調(diào)腸細胞ABCG5/ABCG8的表達

腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白G5和G8(ATP-binding cassette transport G5，ABCG5 和 ATP-binding cassette transport G8，ABCG8)在腸細胞膽固醇流出進入腸腔過程中起重要作用［30］，表達受LXR調(diào)控，是其作用的靶基因［31］。

乳酸菌可以通過上調(diào)ABCG5/ABCG8的表達來促進腸細胞膽固醇的排出［32］，研究人員發(fā)現(xiàn)L.rhamnosus BFE5264和L.plantarum NR74的降膽固醇作用與促膽固醇流出的促進因子ABCG5/8以及脂代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子LXRα/β有關(guān)，并從供試菌株活細胞、熱致死細胞、細胞代謝物、細胞壁4個方面分別考察了其對Caco-2細胞ABCG5/8和LXRα/β表達的影響，其中細胞代謝物對4個基因的表達均無影響，而供試菌株活細胞、熱致死細胞、細胞壁均能提高ABCG5/8和LXRα/β的表達，不論在mRNA還是蛋白水平均得到了證實，因而推測供試菌株細胞壁在控制ABCG5/8和LXRα/β表達上可能起重要作用。乳桿菌細胞壁是由一個與磷壁酸(壁磷壁酸和脂磷壁酸)、多糖和蛋白質(zhì)以共價鍵或非共價鍵形式結(jié)合的厚的肽聚糖層組成［33］，具體是細胞壁中何種組分起作用仍有待于進一步研究證實。

2.2 提高肝細胞膽固醇7α-羥化酶活性

膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1)是膽汁酸“經(jīng)典”合成途徑中的限速酶［34］，膽汁酸在肝臟中合成，膽固醇是其合成的前體物質(zhì)。研究人員以脫脂乳為發(fā)酵基料，對19株乳桿菌和20株雙歧桿菌發(fā)酵脫脂乳后制備的無菌乳清分別處理大鼠原代培養(yǎng)肝細胞，發(fā)現(xiàn)大部分乳清能抑制肝細胞膽固醇的合成與吸收并促進膽汁酸的分泌，進一步研究表明干酪乳桿菌(L.casei)SBT2230和長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)SBT2912發(fā)酵乳清是通過提高膽固醇7α-羥化酶活性來促進膽汁酸分泌的，而這種作用的有效成分可能是源于經(jīng)乳酸菌修飾的牛乳源化合物或是乳酸菌自身分泌的代謝物［35］。

利用腸道細胞模型研究乳酸菌降膽固醇的機制尚處于起步階段，基于現(xiàn)有文獻，乳酸菌對Caco-2細胞膽固醇吸收的影響機制并不十分明確，尚缺少本質(zhì)發(fā)現(xiàn)，且存在菌株特異性，亟需相關(guān)研究報道的支持。此外，影響腸道細胞膽固醇吸收的因素及相關(guān)蛋白很多，需全面考慮。相比于腸細胞，肝細胞模型較早地用于乳酸菌對膽固醇代謝的影響，但相關(guān)報道尚不多見，且僅停留在現(xiàn)象上，并未得到系統(tǒng)證明。

3 體內(nèi)降膽固醇機制

以往體內(nèi)研究關(guān)注的重點在于菌株降膽固醇水平的高低，很少探尋其作用機理。隨著研究的深入，乳酸菌體內(nèi)降膽固醇機制也相繼被提出，主要體現(xiàn)在3個方面:促進膽固醇分解、抑制膽固醇合成和抑制小腸吸收膽固醇。

3.1 促進膽固醇的分解代謝

膽固醇轉(zhuǎn)變成膽汁酸是機體排出膽固醇的主要途徑，膽汁酸作為膽固醇的代謝產(chǎn)物，在人體內(nèi)主要以?；悄懰岷透拾蹦懰醿煞N結(jié)合態(tài)形式存在，并參與肝腸循環(huán)［36］。乳酸菌可以促進膽固醇的分解代謝來降低膽固醇，主要通過兩種機制實現(xiàn):一是乳酸菌通過自身產(chǎn)生的BSH介導(dǎo)的抑制膽汁酸重吸收的作用;二是乳酸菌通過提高膽固醇7α-羥化酶活性來加速膽固醇的分解。

乳酸菌產(chǎn)生的BSH可將結(jié)合型膽酸水解生成游離膽酸，而游離膽酸相比于結(jié)合型膽酸不容易被小腸吸收，大部分不參與肝腸循環(huán)而隨糞便直接排出體外，由于反饋調(diào)節(jié)作用導(dǎo)致膽固醇在肝臟內(nèi)被進一步分解生成新的膽汁酸，從而降低膽固醇［37］。因此，糞便中游離膽酸含量的增加及血清膽固醇水平的降低，將間接指示供試乳酸菌可能是通過其自身產(chǎn)生的BSH來降低膽固醇［8，10］。隨著相關(guān)研究報道的陸續(xù)出現(xiàn)，這似乎已成為乳酸菌降膽固醇的一種公認機制。

此外，糞便膽汁酸分泌量的改變還可能是通過影響膽固醇7α-羥化酶活性來完成。1株L.plantarum KCTC3928活菌株能明顯降低C57BL/6小鼠低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和總甘油三酯(TG)水平，且糞便膽汁酸分泌量明顯增加，同時小鼠肝臟中CYP7A1的mRNA和蛋白表達量相比于對照分別上調(diào)了80%和60%，因此該菌株的降膽固醇作用是通過提高受試動物肝臟膽固醇7α-羥化酶活性來實現(xiàn)［38］。

3.2 抑制膽固醇的合成

膽固醇主要是在肝臟內(nèi)從乙酰輔酶A開始經(jīng)過一系列的生化反應(yīng)合成，其中3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶是膽固醇合成的限速酶［39］。臨床應(yīng)用的主要降膽固醇藥物他汀類化合物就是通過抑制HMG-CoA還原酶活性的機理發(fā)揮作用的。乳酸菌同樣也能抑制HMG-CoA還原酶活性從而降低膽固醇［40］，但這種抑制作用是何種有效成分通過何種途徑來實現(xiàn)的仍不得而知，尚需大量試驗證明。

3.3 抑制小腸對膽固醇的吸收

小腸對膽固醇的吸收受許多因素影響，且存在多種參與膽固醇吸收的轉(zhuǎn)運蛋白，包括NPC1L1、AB-CG5、 ABCG8、 ACAT2、 ABCA1、 ABCG1、 ApoE等［26，41－43］。L.acidophilus ATCC4356 以 109CFU/d的劑量灌胃Sprague-Dawley(SD)大鼠后，大鼠血清總膽固醇(TC)、LDL-C和TG濃度明顯降低，同時在十二指腸和空腸內(nèi)NPC1L1的表達也出現(xiàn)了明顯降低，這表明該菌株的降膽固醇作用至少部分是通過下調(diào)NPC1L1表達介導(dǎo)［44］，這與先前對Caco-2細胞的研究結(jié)果相符［9］。此外，乳酸菌能否通過改變小腸其它轉(zhuǎn)運蛋白的表達來降低膽固醇吸收，仍需更多的研究來闡明并證實。

近年來，乳酸菌體內(nèi)降膽固醇的機制雖有上述一些假說被提出，但仍需大量試驗予以支持。同時，體內(nèi)降膽固醇機制的提出主要基于動物模型試驗，尚缺少乳酸菌在人體內(nèi)降膽固醇的機制假說，這主要是由于人作為實驗對象，某些試驗材料的獲得要受到倫理學(xué)的限制。

4 存在問題與展望

雖然國內(nèi)外研究人員已通過大量試驗從生長培養(yǎng)基、肝細胞或腸細胞模型、受試個體幾個層面分別提出了乳酸菌降膽固醇的各種機制假說，但其作用方式具有菌株特異性且受多種因素影響，故作用機制復(fù)雜，至今尚無定論。

大多數(shù)乳酸菌存在的BSH活性，一度成為公認的降膽固醇機制，但BSH活性乳酸菌在體內(nèi)發(fā)揮降膽固醇作用的同時也存在安全隱患，因為BSH作用生成的游離膽酸，如膽酸和鵝脫氧膽酸，容易被其它腸道細菌修飾分別產(chǎn)生脫氧膽酸和石膽酸，而這兩種化合物可能與結(jié)腸癌的發(fā)生有關(guān)［45］。因此，BSH活性乳酸菌在應(yīng)用前必須進行合理的安全性評價。隨著近幾年研究的深入，膽固醇代謝已成為機制研究的新靶標，試圖從膽固醇代謝角度剖析乳酸菌降膽固醇機制，不論在肝細胞或腸細胞模型還是動物模型中均取得了一些進展，但仍需更多的研究來證實，且研究對象尚局限于膽固醇代謝的某幾個相關(guān)基因，缺乏全面性。目前，乳酸菌對肝臟膽固醇合成與分解代謝相關(guān)酶活性的影響，仍停留在現(xiàn)象上，缺乏本質(zhì)研究。此外，乳酸菌降膽固醇機制的研究多是基于生長培養(yǎng)基、細胞模型或動物模型而提出，均不能反映人體內(nèi)的真實情況，因此通過人體試驗澄清乳酸菌降膽固醇的機制成為當前亟待解決的問題。

近年來，隨著越來越多種屬乳酸菌全基因組測序陸續(xù)完成，轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等組學(xué)技術(shù)不斷成熟與完善，利用組學(xué)技術(shù)從整體上挖掘差異菌株及作用受試細胞或個體的基因表達譜、蛋白質(zhì)表達譜和代謝譜的差異性，通過相關(guān)性分析從本質(zhì)上澄清乳酸菌降膽固醇機制將成為可能，并為研究人體內(nèi)乳酸菌降膽固醇的機制提供新思路與新方法。同時，組學(xué)技術(shù)也將成為闡明乳酸菌與宿主交互及其它益生機理的強有力工具。

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