韓耀坤,杜文彥

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

近年來,隨著骨移植技術的發(fā)展,移植排斥反應越來越引起人們的重視?；A醫(yī)學和臨床醫(yī)學都在不斷地進行骨移植的免疫學方面的研究,尤其是同種異體骨移植和異種骨移植。本文主要就同種異體骨移植的免疫學基礎問題進行討論。學術界認為,異體骨移植引起的免疫反應以活性淋巴細胞和細胞毒抗體的產生為特征,其免疫原主要是細胞膜表面的糖蛋白。

1 骨與軟骨的免疫原性

免疫是機體的免疫系統(tǒng)識別“自己”與“非己”成分并排斥異構物質的生理功能。免疫系統(tǒng)在免疫功能正常的條件下,對“非己”抗原產生排異效應,以保護機體免受抗原異物的侵襲。自體骨移植物與異體骨移植物之間唯一的區(qū)別就是前者是自己器官的組成部分而后者不是。這也就意味著異體骨會被排斥而自體骨和人工骨不會。在第二次移植入同一供者的骨移植物時,由于受者已被前次移植物上的抗原致敏,從而出現(xiàn)排斥反應加速的現(xiàn)象,也就是所謂的二次移植排斥反應。異體骨移植的二次排斥反應說明異體骨具有免疫原性。

抗原(antigen,Ag)是一類能刺激機體免疫系統(tǒng)使之產生特異性免疫應答,并能與相應免疫應答產物在體內外發(fā)生特異性結合的物質。一個完整的抗原應包括兩方面的免疫性能,一是免疫原性 (immunogenicity),指誘導宿主產生免疫應答的能力,包括誘導產生抗體及效應 T淋巴細胞,它必須經過抗原呈遞細胞(antigen presenting cell,APC)的加工、處理和呈遞作用,才能被 T和 B淋巴細胞的抗原識別受體所識別;骨中抗原多為胸腺依賴性抗原,需 T淋巴細胞輔助才能刺激機體產生抗體,引起回憶應答,其刺激機體所產生的抗體多為 IgG,它們還可刺激機體產生細胞免疫。二是免疫反應性(immunorectivity),指抗原與抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異性結合的能力,亦稱為反應原性。免疫原性是抗原最重要的性質,抗原物質是否具有免疫原性,一方面取決于抗原本身的性質,另一方面取決于機體對抗原刺激的反應性。

正常成熟機體的免疫系統(tǒng)能夠區(qū)別宿主自身物質與非自身物質,對自身物質一般不產生免疫應答,只對非自身物質產生免疫應答。這種化學結構與宿主自身成分相異或機體的免疫細胞從未接觸過的物質稱為異物,異物性是抗原物質的首要性質。不同物質之間的免疫原性差別取決于它們化學上的異質性 ,這是免疫識別的物質基礎。一般,物質來源的親緣關系越遠 ,其化學結構差別越大,免疫原性也就越強;而親緣關系越近,免疫原性越弱。因此,異種骨移植物排斥強烈,不能存活;同種骨移植物排斥較弱,可存活一定期限;而自體骨移植物不排斥,可長期存活。

骨組織由礦物質、膠原、非膠原蛋白和細胞成分構成。對于一塊完整的新鮮骨而言,骨髓因富含造血細胞、內皮細胞、樹突細胞等多種細胞成分,其免疫原性最強。有研究發(fā)現(xiàn),去髓對同種異體骨的致敏作用沒有明顯影響,因而骨細胞本身也具有免疫原性。另外,移植骨中殘存血液成分的血型抗原以及骨膠原基質和非膠原蛋白也能引起免疫反應,只是骨膠原基質和非膠原蛋白在不同個體間的差異很小因而其免疫原性很弱。骨骼中的礦物質不具有免疫性。總的來說,骨是一種復合組織,除骨組織本身的細胞成分和骨基質膠原外,還包括神經組織、脂肪組織、小血管和血液成分以及纖維結締組織等,所有這些成分表面都具有遺傳基因控制的特異性抗原,這些抗原均會引起同種異體或異種骨移植后的免疫排斥反應。

軟骨組織由軟骨細胞和周圍致密的蛋白多糖和 II型膠原基質構成。游離的軟骨細胞具有免疫原性,能夠刺激宿主產生免疫反應,但當軟骨面完整無缺時,由于軟骨細胞周圍致密的基質形成屏障,沒有軟骨細胞暴露,此時軟骨細胞處于免疫特免狀態(tài),加上軟骨組織無血管和淋巴管,缺乏血細胞及內皮細胞,因而不會引起明顯的排斥反應。存在于基質中的蛋白多糖和連接蛋白可以游離到滑液中,沉積在滑膜上,并能誘發(fā)宿主產生特異性抗體和細胞免疫,但其免疫原性很低,僅能引起輕微的反應。因而帶部分軟骨基質的軟骨細胞免疫原性比游離的軟骨細胞弱,完整的關節(jié)軟骨比軟骨薄片免疫原性弱,軟骨基質對軟骨細胞具有保護作用。

2 骨組織的主要組織相容性復合體

在定義 T淋巴細胞和 B淋巴細胞之前人們就已經對免疫系統(tǒng)識別同種抗原有了了解。異體骨和其他異體組織和器官一樣具有免疫原性。Muscolo@等的實驗證明,主要組織相容性復合體(M HC)位點不同的大鼠間的交換植骨能誘導受體動物產生體液和細胞免疫,而 M HC位點相同的同系移植(供、受者遺傳基因型完全相同或者基本相似)則不產生免疫反應。Friedlaender等[1]從接受凍干同種異體骨移植的病人體內檢測到抗人類白細胞抗原(HLA)的抗體。Halloran等也證實,小鼠在接受同種異體骨移植后可產生針對 M HC產物的抗體。還有大量其他研究也同樣表明,移植物上被識別的抗原是 M HC(在人類亦稱 HLA)在細胞表面表達的產物。這些 M HC抗原被分為兩類 ,I類和 II類。

M HC-I類抗原在人體內分布廣泛,存在于所有的有核細胞膜上,即在骨細胞、成骨細胞及破骨細胞等細胞表面均表達,但在骨組織的含量較其他組織少。它由兩種非共價結合的糖蛋白組成:重鏈(相對分子質量為44000)和 β 2微球蛋白(相對分子質量為1200)。輕鏈(β 2微球蛋白)在所有的 I類抗原中都是一樣的。而重鏈則表現(xiàn)出高度的多態(tài)性,在人類,它由基因 HLA-A、HLA-B和 HLA-C編碼。在移植排斥中,I類抗原是細胞毒性 T淋巴細胞(cytotoxicT lymphocyte,CTL)識別的目標抗原,能誘導細胞毒抗體的生成及細胞毒性 T細胞反應,是引起移植排斥反應的主要因素。

M HC-II類抗原主要在 B淋巴細胞和其他的輔助細胞(如樹突細胞)表面表達,并能在其他類型的細胞中誘導產生,如巨噬細胞、上皮細胞和血管內皮細胞。它由兩種非共價結合的糖蛋白組成:α鏈(相對分子質量為32000)和 β鏈 (相對分子質量為28000)。M HC-II類抗原包括鼠的 I-A、I-E和人類 HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP抗原,它們由輔助性 T細胞(T helper lymphocyte,Th)識別,是 T細胞活化的必需信號,與機體免疫反應的發(fā)生和調節(jié)有密切的關系。M HC-II類抗原的組織分布有種屬差異性,在骨組織中的分布不清楚。骨髓中含有造血細胞系、內皮細胞、樹突細胞、巨噬細胞等多種細胞成分,它們多有 II類抗原的表達。Skjod等證實成骨細胞亦有 II類抗原表達。

M HC的高度多態(tài)性使無關個體間的 M HC型別不會完全相同,因而對異體組織有不同程度的排斥反應。除主要組織相容性抗原外,細胞表面還存在次要組織相容性抗原,如血型物質、組織特異性抗原、同工酶及 Y染色體伴性抗原等,它們在異體骨移植免疫中的作用尚不明確。

軟骨細胞僅表達 M HC-I類抗原,不表達 M HC-II類抗原,軟骨組織移植后,由于淋巴細胞釋放的細胞因子,如IN F-γ等可發(fā)揮誘導作用 ,使軟骨細胞獲得 M HC-II類抗原的表達,這種表達將增強軟骨移植物的排斥。軟骨細胞表面的 M HC抗原在某些條件下可致敏淋巴細胞,引起免疫反應。

3 白細胞分化抗原

白細胞分化抗原(cluster of differentiation,CD)是不同譜系白細胞系在正?；蚴艽碳ず蠓只统墒爝^程中的某個階段出現(xiàn)或消失的細胞表面標志物,是白細胞膜上的抗原或識別抗原的抗體。CD具有重要的生物學意義,參與識別抗原、捕捉抗原、促進免疫細胞與抗原或免疫分子間的相互作用,介導免疫細胞間、免疫細胞與基質間的粘附作用,在免疫應答的識別、活化及效應階段均發(fā)揮重要作用。

T細胞受體(T cell receptor,TCR)和 CD3均為 T細胞膜上的重要分化抗原,是成熟 T細胞的特征性標志。由 α β異源二聚體組成的 TCR,通過編碼α鏈和β鏈的基因片段的重排,構成具有不同特異性的分子,從而可對各種不同的抗原產生特異性應答。CD3至少由 γ、δ、ε、ζ、η五種多肽鏈組成 ,γ ε、δ ε、ζ ζ呈二聚體狀態(tài)。CD3分子能與 TCR α β 非 共價結合 ,共同完成對抗原呈遞細胞表面 M HC分子-抗原肽復合物的識別及活化信號傳遞。由γ δ異源二聚體組成的 TCR只在約5%的 T細胞表面表達,它的功能還不是太清楚,可能較TCR α β具有更豐富的連接多樣性。T細胞表面的一些結構對TCR與外源性抗原的結合特異性無關,但能通過與靶細胞M HC分子決定簇的連接而很大程度提高細胞與細胞間的相互作用。

CD4為細胞膜表面單鏈糖蛋白,分布于部分 T淋巴細胞(Th表達 CD4分化抗原)和胸腺細胞表面,也發(fā)現(xiàn)于某些 B淋巴細胞和單核吞噬細胞上。CD4陽性 T細胞可識別異體或自身 MHC-II類分子-抗原肽復合物,有助于穩(wěn)定 TCR與M HC-II類分子-抗原肽復合物間的相互作用。另外,CD4分子胞質區(qū)與蛋白酪氨酸激酶 P56lck相聯(lián),對 T細胞信號的轉導起重要作用。

CD8是由α、β兩條多肽鏈組成的穿膜糖蛋白,分布于部分 T淋巴細胞(CTL表達 CD8分化抗原 )、胸腺細胞和 N K細胞。CD8分子與 M HC-I類分子結合可以穩(wěn)定 CTL與帶有M HC-I類分子與抗原復合物的靶細胞結合,介導細胞間粘附作用。目前發(fā)現(xiàn) CD8也與蛋白酪氨酸激酶 P56lck相關,在T細胞增殖和分化的信號轉導中起重要作用。

Stevenson等[2]通過對狗同種異體近端橈骨移植免疫的研究發(fā)現(xiàn),白細胞分化抗原不匹配的新鮮骨移植能刺激受者產生抗供者細胞表面抗原的抗體,這些抗體顯著而持久地存在,并且可檢測到抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC);而CD匹配的骨移植物則沒有可檢測到的抗體也沒有發(fā)現(xiàn)ADCC。

4 免疫學因素對異體骨愈合的影響

異體骨移植不僅要保持肢體骨骼的連續(xù)性,而且更主要的是要保持骨的生物學特性,使異體骨成活。Burchardt認為,異體骨移植與宿主的愈合主要受移植骨抗原性影響,目前常用的處理方法均不能完全破壞異體骨的抗原,術后發(fā)生宿主與供體的免疫反應是難以避免的。免疫反應使異體骨周圍炎癥細胞浸潤、再生血管變性和閉塞,造成骨誘導和骨傳導作用減弱及廣泛的骨吸收,引起骨延遲愈合、不愈合甚至骨折。新鮮自體骨與宿主骨的愈合最優(yōu),同種異體骨移植于宿主骨愈合的優(yōu)劣次序為:凍干骨＞冷凍骨＞脫礦骨＞冷凍+照射骨＞凍干+照射骨＞新鮮骨＞脫蛋白骨。實驗證明,M HC相匹配,有利于骨愈合,提高骨的生物力學特性。1996年,Stevenson等[3]發(fā)現(xiàn) M HC不匹配能激發(fā)特異性免疫反應,這種抗移植物的特異性免疫反應在帶血管的新鮮同種異體骨移植中1周內即可見到,在不帶血管的新鮮同種異體骨移植中3周內能見到,但在冷凍處理的同種異體骨中,則是瞬時的、少見的。Burchardt根據(jù)動物同種異體腓骨移植實驗得出以下結論:若供、受者 M HC抗原差異很小或沒有差異,移植骨與宿主的愈合過程與自體骨移植相似,沒有疲勞骨折,移植16周后移植骨與宿主骨連接,移植骨的成骨量、塑性形均與自體骨移植接近;若供、受者 M HC抗原差異較大,則愈合過程緩慢,較多發(fā)生不連接或延遲連接,可表現(xiàn)為移植骨周邊被吸收或移植骨體積變小,移植骨內部被吸收范圍擴大,延伸至間質板層,移植骨機械強度明顯下降;若供、受者存在著強烈的 M HC抗原差異,則沒有修復征象,移植骨迅速被吸收。可見,在動物體內移植骨的免疫原性與其生物愈合是成反比的。在異體骨移植中,骨松質的愈合是通過在壞死的骨小梁上直接形成新骨,骨小梁間的肉芽組織會阻礙成骨作用,Stevenson等發(fā)現(xiàn),骨移植物的免疫性與骨小梁間纖維結締組織的量成正比,由此可見,免疫反應對骨松質的愈合是不利的。

Muscole[4]等按骨腫瘤協(xié)會評分系統(tǒng)對46例接受冷凍同種異體骨移植的患者進行療效評價,發(fā)現(xiàn)組織學上表現(xiàn)出免疫反應者得分明顯降低,接受部分 HLA-I類抗原匹配的移植物其得分高于完全不匹配者。Friedlaender@等發(fā)現(xiàn),接受大塊冷凍同種異體骨移植的患者,其遠期療效與 HLA-II類抗原的匹配程度有關,HLA-II類抗原的匹配有利于提高同種異體骨移植的遠期療效。上述研究均顯示,對人類而言,M HC的差異對同種異體骨移植的愈合由影響但不似動物體內那么明顯。有學者發(fā)現(xiàn),抗體滴度與移植骨的愈合無顯著的相關性,認為循環(huán)抗體對移植骨沒有危害,移植骨被宿主替代過程中抗原物質的緩慢釋放對宿主起了脫敏作用,使宿主發(fā)生免疫耐受。也有人認為,異體骨移植早期有淋巴細胞浸潤,新骨形成可將殘存異體骨包裹,避免免疫原與宿主的免疫活性細胞接觸誘發(fā)免疫反應。1975年,Laner證實異體骨移植的免疫反應過程中 B細胞會產生一種名為封閉因子(blocking factor)等抗體,這種抗體可以阻止免疫反應進一步擴大。

5 骨移植排斥的防治

由于 M HC具有高度多態(tài)性,同種骨移植后的免疫排斥反應一般都無法避免。減輕同種異體骨移植排斥反應的方法主要有以下幾種:

(1)組織配型:很顯然,如果骨移植物的 M HC與宿主能很好地匹配,免疫排斥反應便不會發(fā)生。采用組織配型可以最大限度地減少供、受者間的組織不相容性,從而提高同種異體骨移植的成功率,但是由于人類的 HLA的高度多態(tài)性,除同卵孿生外,不可能達到完全的組織配型,因而組織配型的目的只是選擇合適的供體,使其與宿主之間有盡可能多的共同抗原。這項工作的開展必須以骨庫的建立為先決條件,首先進行供體和宿主之間的交叉配血試驗,陰性者再進一步做血清配型和混合淋巴細胞培養(yǎng),比較供體和宿主的共同抗原。

(2)對宿主的免疫抑制:免疫抑制藥的應用是臨床上療效最為確切的防治移植排斥反應的方法,通過人為將宿主的免疫功能降低到適當水平,從而克服宿主和移植物之間的排斥反應,其缺點是免疫抑制是非特異性的,是針對所有抗原刺激的,若免疫功能過低,容易合并感染和其他疾病。常用的免疫抑制藥物有如下幾種。

1)化學類免疫抑制劑:包括腎上腺糖皮質激素、環(huán)孢素A(cyclosporinA,CsA)、環(huán)磷酰 胺 (cyclophosphamide,Cy)、硫唑嘌呤 (azathioprine,AZT)、大環(huán)內酯類抗生素 FK506(prograf)、霉酚酸酯 (mycophenolate mofetil,MM F)等。

糖皮質激素是臨床上最常用的免疫抑制藥,其種類很多,最常用的是潑尼松 (prednisone,Pred)、潑尼松龍(prednisolone)、氫化可的松 (hydrocortisone)和甲潑尼龍(methylprednisolone,M P).在宿主接受抗原刺激之前使用糖皮質激素能較為有效地抑制免疫排斥反應,可能是由于皮質激素能抑制白細胞游走,IL-1及其他淋巴因子的產生。

Cy在細胞增殖期和分化期的作用最強,作用于細胞分裂周期的 G2期,因而分裂速度快的 B細胞比 T細胞對 Cy更敏感。它對體液免疫抑制作用較強,能抑制抗體的形成,也可以抑制細胞免疫。

AZT可以抑制嘌呤合成 ,殺死有絲分裂期的細胞,阻滯S晚期或 G2早期的發(fā)展,減低細胞增殖速度,在宿主受抗原刺激后運用較好,其抑制細胞免疫比抑制體液免疫的作用強,抑制 T細胞免疫比抑制 B細胞強。無論細胞免疫還是體液免疫,AZT只能在免疫應答的早期起抑制作用,過早或過晚均無效。M TX能阻止淋巴細胞增殖,抑制宿主產生特異性抗體。

CsA是目前主要的免疫抑制藥,它能抑制 IL-1和 IL-2的產生,抑制淋巴細胞 IL-2受體的表達,從而抑制 CTL的生成、增殖和分化,抑制免疫排斥反應。

FK506的作用機制與 CsA的類似,其主要作用是抑制Th釋放 IL-2和抑制 CTL的增加以及細胞介導和體液免疫應答對移植抗原的反應,其抑制活性是 CsA的100倍。

隨著新型免疫抑制劑相繼問世,免疫抑制劑組合方案也正在出現(xiàn)新的格局和變化,如 FK506+Pred+MM F聯(lián)合應用。新型免疫抑制劑 FTY-720可改變淋巴細胞的歸宿,改變抗黏附分子(ICAM-1)的合成及表達,可能通過改變 Bcl-2/Bax的比值誘導淋巴細胞凋亡。FTY-720與多種免疫抑制劑如 CsA有良好的協(xié)同作用,有很高的生物利用度,且藥物毒性反應小。

2)生物制劑:主要是某些抗免疫細胞膜抗原的抗體,如淋巴細胞球蛋白(ALG),抗胸腺細胞球蛋白(ATG),抗 CD3,抗 CD4和抗 CD8單克隆抗體,抗 TCR單克隆抗體,抗 ICAM-1抗體等。這些抗體通過與相應膜抗原結合,借助補體依賴的細胞毒作用,分別清楚體內的 T細胞或胸腺細胞。

3)中草藥類免疫抑制劑:某些中草藥具有明顯的免疫調節(jié)或免疫抑制作用,如雷公藤、冬蟲夏草等。雷公藤多苷是雷公藤根生藥的水-氯仿提取物,它保留了雷公藤的免疫抑制作用,去除了某些毒性成分。雷公藤多苷能抑制 IL-2的分泌,抑制 T淋巴細胞增殖早期 IL-2受體的表達。

移植前進行血漿置換,可除去受者血液內預存的特異性抗體,以防止超急性排斥反應。臨床上還應用脾切除,放射線照射骨移植物或受者淋巴結等技術來防治排斥反應。

(3)移植骨抗原處理:由于同種異體骨移植物可以沒有存活細胞,因此可以采用多種方法,盡量去除或殺死骨移植物內的細胞成分,以減弱其抗原性。盡量徹底刮除移植骨的骨髓、骨膜,反復洗滌,是簡單有效的去除抗原方法,但機械方法不可能完全去除移植骨的細胞成分。目前多采用煮沸、射線輻照、冷凍、高溫煅燒、脫蛋白處理來降低骨移植物的免疫原性以減弱排斥反應。脫鈣、冷凍和凍干都過于溫和,不足以消除異種骨的抗原性;煮沸、煅燒、大劑量射線輻照和化學脫蛋白又太劇烈,破壞了移植骨內有益的生物活性物質[5]。

綜上所述,骨移植的免疫學研究還處于不斷完善的階段。到目前為止,還沒有一種十分理想的方法能夠既保存異體骨的生物活性又能消除其抗原性。這需要學術界不斷進行研究和完善。隨著干細胞技術和基因技術的發(fā)展,人類一定能夠攻克這一難題。

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