徐迎陽(yáng)，支玉香

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科，北京 100730)

ChinJAllergyClinImmunol,2013,7(2)：125-128

遺傳性血管性水腫(hereditary angioedema, HAE)是一種較少見(jiàn)的常染色體顯性遺傳病，其發(fā)生率約為1∶50 000～1∶10 000[1-2]，主要表現(xiàn)為反復(fù)性皮下或黏膜下水腫[3]。HAE可累及身體任何部位，其中以四肢、顏面、生殖器及消化道和呼吸道黏膜較為常見(jiàn)[3]。因呼吸道黏膜水腫存在可致快速呼吸困難或窒息的潛在風(fēng)險(xiǎn)而被認(rèn)為是一種危及生命的急性水腫發(fā)作，死亡率可達(dá)30%～40%[4-5]，嚴(yán)重影響患者生命，因此受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注。目前將HAE分為3種亞型[6]。傳統(tǒng)上認(rèn)為HAE即C1抑制物(C1 inhibitor，C1 INH)缺乏癥，由于C1 INH編碼基因突變導(dǎo)致該蛋白產(chǎn)物功能缺陷所引起，即1型和2型HAE。3型HAE與C1 INH基因突變無(wú)關(guān)，目前研究結(jié)果多顯示此亞型發(fā)病與凝血因子FⅫ編碼基因突變有關(guān)[7-8]。

迄今為止，國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的與HAE發(fā)病相關(guān)的C1 INH基因突變多達(dá)兩百余種[9]，具有很大的異質(zhì)性。除最近對(duì)中國(guó)HAE患者進(jìn)行較大樣本的C1 INH基因突變報(bào)道外[10]，其余僅見(jiàn)少數(shù)單個(gè)家系報(bào)道[11-12]。本文對(duì)2011至2012年北京協(xié)和醫(yī)院7例來(lái)自不同HAE家系的先證者進(jìn)行基因突變分析，豐富中國(guó)HAE患者C1 INH基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)。

對(duì)象和方法

對(duì)象

2011至2012年北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科診斷為Ⅰ型HAE來(lái)自不同HAE家系的先證者7例。診斷標(biāo)準(zhǔn)為反復(fù)發(fā)作的皮膚和或黏膜水腫，伴補(bǔ)體C4濃度降低、C1 INH濃度及功能降低，而C1q正常。另于2012年由北京協(xié)和醫(yī)院體檢中心募集53名健康成人為對(duì)照組，補(bǔ)體篩查C4濃度及C1 INH水平均正常，且無(wú)HAE家族史。本研究獲得北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，每名受試者均簽署知情同意書(shū)。

基因分析方法及試劑

分別采集HAE患者及對(duì)照組外周靜脈血2 ml，置EDTA抗凝管中。鹽析法提取外周血基因組DNA，分光光度計(jì)測(cè)量光密度(Optical Density，OD)260及280值。根據(jù)GenBank中C1 INH參考序列X54486，設(shè)計(jì)C1 INH基因8個(gè)外顯子的擴(kuò)增引物。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)反應(yīng)體系50 μl(10×PCR緩沖液5 μl，MgSO43 μl，dNTP 8 μl，正向反向引物各1 μl，F(xiàn)astStar Taq 0.5 μl，模板DNA 2 μl，ddH2O 28.5 μl)。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，51～60℃退火1 min，72℃延伸30 s，循環(huán)40次；72℃，10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，送華大基因測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)核苷酸序列X54486 (BA123456，GenBank)進(jìn)行比對(duì)以鑒定突變。核苷酸計(jì)數(shù)包括2種方法：(1)以第一外顯子上第一個(gè)核苷酸計(jì)為+1；(2)根據(jù)人類(lèi)基因組突變協(xié)會(huì)(Human Genome Variation Society, HGVS)推薦以編碼序列(coding sequence, CDS)上翻譯起始密碼子ATG的A計(jì)為CDS+1。氨基酸計(jì)數(shù)以包含信號(hào)肽的未成熟蛋白的第一個(gè)氨基酸殘基Met為+1。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP) 檢測(cè)：序列比對(duì)后，DNA序列上發(fā)生的單個(gè)核苷酸堿基的變異，在人群中(包括健康對(duì)照和患者)這種變異的發(fā)生頻率大于1%者，鑒定為SNP。

結(jié)　　果

C1 INH基因突變

7例HAE先證者C1 INH基因中共發(fā)現(xiàn)7種不同突變，3種無(wú)義突變和4種移碼突變(表1)。測(cè)序圖見(jiàn)圖1。對(duì)照組中均無(wú)以上改變。

SNP檢測(cè)

7種SNP分別是g.1965 G>A，g.3248T>C，g.3493T>C，g.5755 G>A，g.9498 T>C，g.15193 A>G，g.18012 G>A(表2)。其中g(shù).1965 G>A，g.5755 G>A，g.9498 T>C既往未見(jiàn)報(bào)道，已由筆者提交至寡核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)(database of SNP，dbSNP)數(shù)據(jù)庫(kù)，并獲得檢索序號(hào)。

討　　論

C1 INH是目前已知活化C1r和C1s的唯一抑制物，并通過(guò)這一抑制作用阻止補(bǔ)體經(jīng)典途徑激活。在接觸系統(tǒng)中C1 INH能夠抑制激肽釋放酶原活化及激肽釋放酶和FⅫa的全部活性。激肽釋放酶原、激肽釋放酶及FⅫa是參與緩激肽合成級(jí)聯(lián)反應(yīng)的主要蛋白。因此，C1 INH缺陷會(huì)引起緩激肽合成級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)分激活，產(chǎn)生過(guò)量緩激肽，后者通過(guò)增加血管壁的通透性，導(dǎo)致水腫發(fā)生[13-16]。C1 INH由9個(gè)α-螺旋、3個(gè)β-折疊和1個(gè)反應(yīng)環(huán)(reactive central loop，RCL)構(gòu)成，RCL是C1 INH與靶蛋白酶相互作用部位，故RCL是C1 INH發(fā)揮功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[17]。C1 INH缺陷使其對(duì)靶蛋白酶抑制作用減弱，導(dǎo)致靶酶活性增高，使得補(bǔ)體系統(tǒng)過(guò)度活化，表現(xiàn)為C4濃度降低，接觸系統(tǒng)則表現(xiàn)為激肽釋放酶活化增強(qiáng)以及緩激肽生成增多，最終導(dǎo)致血管性水腫的發(fā)生。

表1　C1抑制物基因突變檢測(cè)結(jié)果

HUGO：國(guó)際人類(lèi)基因組組織；CDS：編碼序列；exon：外顯子

表2　C1抑制物基因單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果

HUGO：國(guó)際人類(lèi)基因組組織；CDS：編碼序列；exon：外顯子；intron：內(nèi)含子；*由本文作者提交至寡核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)

C1 INH基因位于11號(hào)染色體q11-q13.1，含有8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子[18]，典型的HAE(1型和2型)是由于C1 INH基因突變導(dǎo)致編碼蛋白量的缺乏或功能缺陷所致。此前一項(xiàng)針對(duì)48例HAE患者進(jìn)行的C1 INH基因突變研究發(fā)現(xiàn)了34種不同突變，初步建立了我國(guó)C1 INH突變數(shù)據(jù)庫(kù)[10]。本研究對(duì)7例Ⅰ型HAE患者進(jìn)行突變篩查，共鑒定7種突變，其中突變c.289 C

突變c.44 delT、c.939 delT、c.1214-1223 delCCAGCCAGGA及c.1279 delC因出現(xiàn)缺失數(shù)量非3整數(shù)倍的堿基缺失使編碼框發(fā)生移位，并分別在其下游序列形成終止密碼子。以上4種移碼突變所形成終止子分別位于氨基酸序列第78、320、427和428位，均位于反應(yīng)鍵第466位Arg上游，故其蛋白產(chǎn)物同樣不包括RCL，導(dǎo)致C1 INH蛋白無(wú)功能而引發(fā)HAE。除c.1279 delC曾有報(bào)道[10]外，c.44 delT、c.939 delT及c.1214-1223 delCCAGCCAGGA均為首次報(bào)道。

此外，本研究在HAE患者及對(duì)照組中共檢測(cè)到7種SNP。其中g(shù).2066T>C、g.2311 T>C、g.14011 A>G及g.16830 G>A已被HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)收錄。g.738 G>A、g.4573 G>A及g.8316 T>C已由筆者提交至dbSNP, 并獲得檢索號(hào)(rs199473715、rs11229063及rs141593943)。

綜上所述，本研究對(duì)7例HAE患者進(jìn)行C1 INH基因序列分析，共鑒定7種不同的C1 INH基因突變，其中5種為國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道，豐富了中國(guó)C1 INH基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)。希望通過(guò)對(duì)C1 INH進(jìn)行基因檢測(cè)，為HAE家系成員提供遺傳咨詢(xún)，且為尚未發(fā)病及表現(xiàn)不典型的HAE患者的診斷提供幫助。

(本文圖1見(jiàn)封2)

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