黃翠平，周京國(guó)，謝文光，青玉鳳，殷　玲，胡程飛

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕血液科，四川南充 637000)

ChinJAllergyClinImmunol， 2013， 7(2)：120-124

干燥綜合征(Sjogren’s syndrome，SS)分為原發(fā)性干燥綜合征(primary Sjogren’s syndrome, pSS)和繼發(fā)性干燥綜合征(secondary Sjogren’s syndrome, sSS)，是以淚腺及唾液腺等外分泌腺體受累為主的慢性炎性自身免疫性疾病。主要臨床特點(diǎn)為淚腺和唾液腺分泌減少，形成干燥性角膜結(jié)膜炎和口腔干燥，也可累及呼吸道、消化道、泌尿道、神經(jīng)、肌肉、關(guān)節(jié)等，造成多系統(tǒng)、多器官受損。pSS是不伴有其他任何疾病的單純性SS；sSS患者除了SS以外，還合并類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化等其他疾病。國(guó)內(nèi)成人pSS患病率為0.29%～0.77%，30～50歲女性占全部pSS病例的90%左右[1]。希臘2006年流行病學(xué)調(diào)查顯示pSS患病率為0.09%[2]。pSS的發(fā)病主要與環(huán)境、遺傳、免疫及內(nèi)分泌代謝有關(guān)，但具體發(fā)病機(jī)制至今仍不清楚。

毒蕈堿型乙酰膽堿受體(muscarinic acetylcholine receptor)，簡(jiǎn)稱M受體，是一種單鏈跨膜糖蛋白，屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，起著在周圍神經(jīng)系統(tǒng)介導(dǎo)腺體分泌、平滑肌收縮、心肌收縮等重要生理功能。M受體蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約51 000～66 000，由460～590個(gè)氨基酸殘基組成，N端在胞膜外，C端在胞質(zhì)內(nèi)，7次跨過(guò)細(xì)胞膜。M型受體已分出多種亞型，其中毒蕈堿型乙酰膽堿受體亞型3(muscarinic acetylcholine receptor M3，CHRM3)主要分布在外分泌腺上，神經(jīng)和平滑肌也有少量分布。乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)與腺體腺泡細(xì)胞膜上CHRM3結(jié)合后，引起淚腺、氣管和支氣管腺體、唾液腺、消化道腺體和汗腺分泌增加。

本文應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測(cè)pSS患者CHRM3 mRNA表達(dá)，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)pSS患者血漿中抗毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3亞型抗體(M3 muscarinic acetylcholine receptor antibody，CHRM3-Ab)濃度，并與臨床指標(biāo)進(jìn)行分析，以探討其在pSS發(fā)病機(jī)制中可能的作用。

材料和方法

研究對(duì)象及分組

pSS組：選擇川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕科2010年4月至2011年12月門診及住院pSS患者43例，診斷均符合2002年pSS的歐洲修訂分類診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。正常對(duì)照組：同期29名川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院健康體檢女性。收集pSS患者及健康體檢女性臨床資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。本研究得到當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)支持，且所有參與者均知情同意。

方法

主要儀器和試劑：低溫高速離心機(jī)5417R(Eppendorf公司，USA)，7900 Real-Time PCR儀(ABI公司，USA)，Beckman Immage免疫分析儀(Beckman公司，USA)。熒光染料試劑盒Power SYBR Green PCR Master Mix(ABI公司，USA)，TRIZOL試劑(Invitrogen公司)。

pSS患者常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)測(cè)定：血細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate, ESR)按魏氏法進(jìn)行操作，類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor, RF)與C反應(yīng)蛋白(C-reaction protein，CRP)用速率散射比濁法(rate nephelometry method)檢測(cè)，使用美國(guó)Beckman公司Immage免疫分析儀，試劑為Beckman公司配套試劑。

總RNA提取及cDNA合成：采用抽簽法隨機(jī)選擇21例pSS患者及24名健康女性，收集其晨起空腹外周靜脈血，去血漿血液用磷酸鹽緩沖液補(bǔ)充至原體積，將制備好的細(xì)胞懸液緩慢置于等體積淋巴細(xì)胞分離液上，離心后吸取白色云霧狀細(xì)胞，再離心洗滌后加入Trizol試劑(Invitrogen)，充分震蕩混勻放置5 min，再添加氯仿，混勻后室溫靜置3 min；離心后吸出上層水相至另一eppendorf微型離心管，加等體積異丙醇并充分混勻，室溫靜置30 min；離心、棄上清液，加入1 ml 75%乙醇洗滌沉淀，離心后吸干乙醇，空氣中干燥；加入無(wú)RNA酶溶解RNA。取RNA樣品電泳，在1.0%普通瓊脂糖凝膠圖譜中顯示3條帶，紫外分光光度儀測(cè)定A260/A280(1.8～2.0者采用)。取總RNA于42℃反應(yīng)60 min，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，凍存于-40℃?zhèn)溆谩?/p>

CHRM3及內(nèi)參β-actin基因表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)兩組外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)CHRM3轉(zhuǎn)錄水平。用于擴(kuò)增CHRM3及內(nèi)對(duì)照β-actin基因的引物由上海生工生物工程公司合成，序列如表1所示。CHRM3的PCR產(chǎn)物為107 bp，β-actin的PCR產(chǎn)物為128 bp。采用25 μl反應(yīng)體系，包括12.5 μl Power SYBR Green PCR Master Mix，各1 μl 10 pmol/L 引物，2 μl cDNA，8.5 μl雙蒸水。反應(yīng)條件為95℃ 10 min 先預(yù)熱，再95℃ 1 min，60℃ 15 s，72℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)，最后延伸72℃ 5 min。每份標(biāo)本均作復(fù)孔，復(fù)孔間的Ct值差異控制在0.5以內(nèi)。所有擴(kuò)增均在ABI 7900 Real-Time PCR儀上進(jìn)行。

反應(yīng)結(jié)束后作溶解曲線。以目的基因的Ct值減去內(nèi)參的Ct值為△Ct，2-△Ct值表示目的基因mRNA表達(dá)水平的高低。

表1　CHRM3及內(nèi)對(duì)照β-actin基因的引物序列

CHRM3：毒蕈堿型乙型膽堿受體亞型3

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)兩組血漿CHRM3-Ab濃度：采集43例pSS患者及29名健康女性晨起空腹外周靜脈血，分離出血漿并分裝，所有血漿樣品在-80℃ 凍存。在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品、空白、待測(cè)樣品孔，待測(cè)樣品最終稀釋5倍；置37℃溫育30 min 后反復(fù)洗滌待測(cè)孔5次，拍干后每孔加入酶標(biāo)試劑，再置37℃溫育30 min后重復(fù)上述洗滌過(guò)程，拍干后每孔先加入顯色劑A，再加入顯色劑B，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min，再在每孔加終止液終止反應(yīng)，以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)　　果

臨床資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

pSS組所有患者均為女性，年齡25～63歲，平均(49.1±10.8)歲，病程1～15年，平均(5.7±3.0)年。正常對(duì)照組女性年齡33～57歲，平均(43.7±6.5歲)。兩組年齡構(gòu)成比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、血小板計(jì)數(shù)、白蛋白及球蛋白水平的比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中淋巴細(xì)胞絕對(duì)值及球蛋白水平的差異更為顯著(P<0.01)(表2)。

CHRM3轉(zhuǎn)錄水平及CHRM3-Ab比較

pSS組CHRM3轉(zhuǎn)錄水平及CHRM3-Ab均顯著高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

CHRM3轉(zhuǎn)錄水平、CHRM3-Ab與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

pSS組CHRM3-Ab濃度與血細(xì)胞沉降率、IgG呈負(fù)相關(guān)(r分別=-0.452、-0.470，均P<0.05)，與其他臨床指標(biāo)無(wú)相關(guān)性(均P>0.05)。CHRM3轉(zhuǎn)錄水平與各臨床指標(biāo)均無(wú)相關(guān)性(均P>0.05)(表4)。

正常對(duì)照組CHRM3-Ab濃度與中性粒細(xì)胞絕對(duì)值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.679，P<0.05)，與其他臨床指標(biāo)之間無(wú)相關(guān)性(均P>0.05)。CHRM3轉(zhuǎn)錄水平與各臨床指標(biāo)之間均無(wú)相關(guān)性(均P>0.05)(表5)。

表2pSS組與正常對(duì)照組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

分組白細(xì)胞計(jì)數(shù)(×109/L)中性粒細(xì)胞絕對(duì)值(×109/L)淋巴細(xì)胞絕對(duì)值(×109/L)血紅蛋白(g/L)血小板(×109/L)尿素(mmol/L)尿酸(μmol/L)白蛋白(g/L)球蛋白(g/L)正常對(duì)照組63±1733±0924±091276±841604±50542±092595±385431±11274±30pSS組50±1729±1314±091402±8341246±59940±122539±747406±50329±73P值<005>005<001>005<005>005>005<005<001

pSS：原發(fā)性干燥綜合征

表3pSS組與正常對(duì)照組CHRM3轉(zhuǎn)錄水平及CHRM3-Ab比較

分組CHRM3轉(zhuǎn)錄水平CHRM3?Ab(pmol/L)正常對(duì)照組000009±00000414144±7104pSS組000014±00003022729±15481P值<005<001

pSS：原發(fā)性干燥綜合征；CHRM3：毒蕈堿型乙酰膽堿受體亞型M3；CHRM3-Ab：毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3亞型抗體；CHRM3轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平以2-△Ct計(jì)算

表4　pSS患者CHRM3轉(zhuǎn)錄水平、CHRM3-Ab與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)相關(guān)性

pSS：原發(fā)性干燥綜合征；CHRM3：毒蕈堿型乙酰膽堿受體亞型M3；CHRM3-Ab：毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3亞型抗體

表5　正常對(duì)照組CHRM3轉(zhuǎn)錄水平、CHRM3-Ab與臨床指標(biāo)的相關(guān)性

pSS：原發(fā)性干燥綜合征；CHRM3：毒蕈堿型乙酰膽堿受體亞型M3；CHRM3-Ab：毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3亞型抗體

討　　論

Beroukas等[4]發(fā)現(xiàn)在pSS患者的唇腺組織石蠟切片標(biāo)本中腺泡細(xì)胞膜上CHRM3數(shù)目有顯著上調(diào)，CHRM3上調(diào)與神經(jīng)遞質(zhì)傳導(dǎo)抑制作用一致，并認(rèn)為這種抑制作用可能與pSS患者血清中存在的特殊抗體對(duì)CHRM3的拮抗有關(guān)。Koo等[5]用SS患者純化的IgG作用于合成CHRM3肽，發(fā)現(xiàn)IgG能夠與CHRM3肽特定的表位結(jié)合。He等[6]用人工合成CHRM3肽序列研究發(fā)現(xiàn)，pSS患者CHRM3-Ab可與CHRM3肽特定的序列結(jié)合，與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者比較，CHRM3-Ab陽(yáng)性率在pSS患者中明顯升高，但文中并沒(méi)有關(guān)于pSS患者CHRM3-Ab的定量報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，pSS患者CHRM3-Ab濃度顯著高于正常對(duì)照組，推測(cè)CHRM3-Ab可能在pSS的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮了一定的作用。

有文獻(xiàn)報(bào)道，在人類PBMCs中有CHRM3表達(dá)[7-8]。Kawashima和Fuji[9]研究發(fā)現(xiàn)，淋巴細(xì)胞中有Ach及M受體的表達(dá)，并提及ACh及毒蕈堿型乙酰膽堿受體激動(dòng)劑經(jīng)CHRM3介導(dǎo)可能引起T、B淋巴細(xì)胞內(nèi)信號(hào)改變。本文通過(guò)對(duì)pSS患者及健康體檢者PBMCs的研究發(fā)現(xiàn)，pSS患者CHRM3 mRNA表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組，推測(cè)CHRM3可能參與了pSS的發(fā)病，其具體影響機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

pSS病變主要累及柱狀上皮細(xì)胞構(gòu)成的外分泌腺，以唾液腺和淚腺為主。病理特點(diǎn)為腺體間質(zhì)有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、腺體導(dǎo)管管腔擴(kuò)張或狹窄等，小唾液腺上皮細(xì)胞有破壞和萎縮。Waterma等[10]研究發(fā)現(xiàn)，將SS患者血清中純化的CHRM3-Ab用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，其可拮抗小鼠膀胱平滑肌上的CHRM3，抑制小鼠膀胱平滑肌副交感神經(jīng)系統(tǒng)ACh信號(hào)的有效傳遞。2010年，Iizuka等[11]用CHRM3肽免疫小鼠后，發(fā)現(xiàn)小鼠血清中有高滴度的CHRM3-Ab，而唾液中含量少。本研究發(fā)現(xiàn)，pSS患者PBMCs中CHRM3表達(dá)及血漿中CHRM3-Ab濃度均明顯高于正常對(duì)照組，二者可能通過(guò)一定的作用機(jī)制參與pSS的發(fā)病過(guò)程。筆者推測(cè)，可能由于pSS的某些病理機(jī)制使體內(nèi)CHRM3的表達(dá)反饋性升高，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量CHRM3-Ab，過(guò)多的CHRM3-Ab與CHRM3結(jié)合，影響正常神經(jīng)遞質(zhì)Ach與CHRM3的結(jié)合及其后受體系統(tǒng)信號(hào)的有效傳導(dǎo)，從而影響了唾液腺及淚腺等的分泌，使pSS患者表現(xiàn)出口干及眼干癥狀。

本研究還發(fā)現(xiàn)，pSS組及正常對(duì)照組就白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、血小板計(jì)數(shù)、白蛋白及球蛋白水平的比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且其中淋巴細(xì)胞絕對(duì)值及球蛋白水平的差異更為顯著，提示pSS的發(fā)病過(guò)程有炎性反應(yīng)及免疫因素的參與。pSS患者CHRM3-Ab濃度與血細(xì)胞沉降率及IgG呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)CHRM3-Ab可能參與了pSS的炎性反應(yīng)與免疫調(diào)節(jié)。加強(qiáng)對(duì)CHRM3和CHRM3-Ab的研究，有望為pSS的治療帶來(lái)新契機(jī)。

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