周晶晶，汪國(guó)生，李向培，厲小梅，錢　龍

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，合肥 230001)

ChinJAllergyClinImmunol， 2013， 7(2)：109-114

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種典型的免疫功能紊亂、累及多系統(tǒng)的自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為T、B淋巴細(xì)胞異?；罨⒃鲋澈头只?，產(chǎn)生多種自身抗體[1-2]。SLE發(fā)病機(jī)制不明，主要由免疫異常、基因突變、性激素及環(huán)境等多種因素共同參與。研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者體內(nèi)多種細(xì)胞因子存在異常，且血清中異常細(xì)胞因子類型不同，其臨床表現(xiàn)也不相同，提示SLE患者體內(nèi)不同細(xì)胞因子譜可能引發(fā)了不同的臨床特征[3]。近年來(lái)，血清干擾素α(interferon α，IFN-α)異常升高在SLE發(fā)病中的重要性日益受到關(guān)注，同時(shí)白介素6(interleukin 6，IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的異常高表達(dá)在SLE患者中也普遍存在。本研究檢測(cè)SLE患者血清中IFN-α、IL-6及TNF-α的水平，分析其與實(shí)驗(yàn)室及臨床指標(biāo)的相關(guān)性，為了解SLE的發(fā)病機(jī)制，評(píng)估患者病情，指導(dǎo)臨床治療奠定基礎(chǔ)。

對(duì)象和方法

對(duì)象及分組

SLE組：選取安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院風(fēng)濕免疫科門診及住院SLE患者共45例，診斷均符合1997年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(American College of Rheumatology，ACR)制定的SLE分類標(biāo)準(zhǔn)。其中男3例，女42例，年齡(14～72)歲，平均年齡31.6歲。依據(jù)SLE疾病活動(dòng)指數(shù)(SLE disease activity index，SLEDAI)[4]對(duì)疾病活動(dòng)度進(jìn)行評(píng)估，<10分為穩(wěn)定期，33例患者；≥10分為活動(dòng)期，12例患者。根據(jù)抗雙鏈DNA(double-stranded DNA，dsDNA)抗體將SLE患者分為抗dsDNA抗體陽(yáng)性組及陰性組。根據(jù)血紅蛋白水平將SLE患者分為血紅蛋白正常組(男120～160 g/L，女110～150 g/L)及減低組(男<120 g/L，女<110 g/L)。

正常對(duì)照組：自安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院健康志愿者20名，性別和年齡均與SLE患者相匹配。

方法

試劑及主要儀器：人IFN-α、IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(ELISA Kit)購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。自動(dòng)洗板機(jī)及酶標(biāo)儀均產(chǎn)自?shī)W地利。-80℃超低溫冰箱購(gòu)自日本SANYO公司。

樣本采集和血清分離：清晨空腹采集SLE患者和健康對(duì)照者肘靜脈血3 ml，EDTA抗凝，室溫靜置2 h，待其析出血清，3 000 r/min離心10 min，留取上層血清，分裝至Eppendorf管中，置于-80℃冰箱保存。

血清IFN-α、IL-6、TNF-α檢測(cè)：所有操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，簡(jiǎn)單步驟如下：潤(rùn)板，Wash Buffer浸潤(rùn)微孔板；加血清樣本；加人生物素標(biāo)記抗體(Biotin)；室溫(18℃～25℃)孵育2 h，洗滌；加親和素-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，室溫(18℃～25℃)孵育1 h，洗滌，加TMB顯色，避光孵育10～15 min；加終止液；讀取酶標(biāo)儀上A450值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出待測(cè)樣本中各細(xì)胞因子濃度(ng/L)。

實(shí)驗(yàn)室檢查：SLE患者相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查包括血常規(guī)、尿常規(guī)、血細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C-反應(yīng)蛋白、免疫球蛋白及補(bǔ)體，上述指標(biāo)均在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心完成；抗核抗體全套滴度、抗dsDNA抗體及紅斑狼瘡活動(dòng)指標(biāo)的檢測(cè)在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院風(fēng)濕病實(shí)驗(yàn)室完成。所有檢測(cè)均按照國(guó)際統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

臨床指標(biāo)：觀察并記錄SLE患者皮疹、口腔潰瘍、發(fā)熱、關(guān)節(jié)痛、腎臟受累、血細(xì)胞減低等臨床表現(xiàn)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)　　果

血清IFN-α、IL-6及TNF-α水平

SLE組血清IFN-α及IL-6濃度顯著高于正常對(duì)照組，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；而血清TNF-α水平與正常對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。其中SLE活動(dòng)期患者血清IFN-α

水平明顯高于穩(wěn)定期患者[(9.79±12.04)ng/Lvs.(3.13±3.47)ng/L，P<0.05]。

SLE患者血清IFN-α、IL-6、TNF-α間相關(guān)性

SLE患者血清IFN-α水平與TNF-α水平呈正相關(guān)(r=0.303，P<0.05)，而與IL-6無(wú)相關(guān)性；IL-6水平與TNF-α也無(wú)相關(guān)性。

SLE血清IFN-α、IL-6、TNF-α與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的關(guān)系

SLE患者中抗dsDNA抗體陽(yáng)性組血清IFN-α、IL-6 水平明顯高于抗dsDNA抗體陰性組(均P<0.05)；血紅蛋白減低組血清IFN-α水平顯著高于血紅蛋白正常組(P<0.05)(表2)。

SLE患者血清IFN-α水平與抗dsDNA抗體呈正相關(guān)(r=0.368，P<0.05)，與血紅蛋白水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.354，P<0.05)；IL-6水平與抗dsDNA抗體(r=0.437，P<0.05)及ESR均呈正相關(guān)(r=0.526，P<0.01)；TNF-α水平與各實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)均無(wú)相關(guān)性。

表1SLE患者和正常對(duì)照者血清IFN-α、IL-6、TNF-α水平比較

SLE：系統(tǒng)性紅斑狼瘡；IFN-α：干擾素α；IL-6：白介素6；TNF-α：腫瘤壞死因子α；*與正常對(duì)照組相比，P<0.05

表2SLE患者血清IFN-α、IL-6、TNF-α比較

SLE：系統(tǒng)性紅斑狼瘡；IFN-α：干擾素α；IL-6：白介素6；TNF-α：腫瘤壞死因子α；*與抗dsDNA陰性組相比，P<0.05；#與血紅蛋白正常組相比，P<0.05

SLE患者血清IFN-α、IL-6、TNF-α與SLEDAI及臨床指標(biāo)的關(guān)系

SLE患者血清IFN-α水平與SLEDAI積分呈正相關(guān)(r=0.427，P<0.01)(圖1)。

SLE患者中出現(xiàn)皮疹者14例(31%)，出現(xiàn)口腔潰瘍者9例(20%)，出現(xiàn)發(fā)熱者8例(18%)，出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎者15例(33%)，出現(xiàn)腎臟受累11例(24%)，出現(xiàn)血液系統(tǒng)損害者13例(29%)。血清IFN-α水平和血液系統(tǒng)損害有密切的關(guān)系，其在有血液系統(tǒng)受累的患者中表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。血清IL-6水平在伴有發(fā)熱、關(guān)節(jié)炎或血液系統(tǒng)損害的患者中明顯高于無(wú)上述臨床表現(xiàn)的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。血清TNF-α表達(dá)增高與多種臨床表現(xiàn)相關(guān)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

圖1SLE患者血清IFN-α水平與SLEDAI的相關(guān)性

Fig1Correlation between the level of IFN-α and SLEDAI in SLE patients

SLE：系統(tǒng)性紅斑狼瘡；IFN-α：干擾素α；SLEDAI：SLE疾病活動(dòng)指數(shù)

表3SLE患者臨床特征與血清IFN-α、IL-6、TNF-α的關(guān)系

臨床表現(xiàn)例數(shù)(n)IFN?αIL?6TNF?α檢測(cè)值P值檢測(cè)值P值檢測(cè)值P值皮疹　有14567±7200179672±11420189663±10640215　無(wú)31333±377246±216317±447口腔潰瘍　有9450±2700922169±1890511185±1090412　無(wú)36422±565420±746562±897發(fā)熱　有8636±96104891631±24430001550±8870514　無(wú)37408±513295±284208±176關(guān)節(jié)炎　有15655±10270726742±12150048597±9960328　無(wú)30424±573273±244325±333腎臟受累　有11897±13130248536±7060388581±9510313　無(wú)34378±427402±789270±132血液系統(tǒng)損害　有13571±7130036445±3890042666±12230454　無(wú)32274±367220±178500±703

SLE：系統(tǒng)性紅斑狼瘡；IFN-α：干擾素α；IL-6：白介素6；TNF-α：腫瘤壞死因子α

討　　論

細(xì)胞因子的分泌調(diào)控著人體的正常免疫反應(yīng)，當(dāng)其分泌異常時(shí)，機(jī)體免疫高度活化，可誘發(fā)自身免疫性疾病。近年來(lái)多項(xiàng)研究均證明，參與免疫調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失調(diào)在SLE發(fā)病及疾病進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。

IFN-α主要由漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cells，pDCs)合成分泌，主要在機(jī)體受到外界細(xì)菌或病毒等刺激的情況下產(chǎn)生，具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)功能。然而，機(jī)體內(nèi)源性核酸物質(zhì)或核酸含有的免疫復(fù)合物也可激活pDCs，使其產(chǎn)生大量IFN-α，從而導(dǎo)致SLE發(fā)病。本研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者血清中IFN-α水平較正常人明顯升高，這與Willis等[5]的研究報(bào)道一致。IFN-α是SLE的標(biāo)志性細(xì)胞因子，也是研究最多的與SLE相關(guān)的細(xì)胞因子，其與疾病活動(dòng)度、病情輕重及免疫活化等密切相關(guān)[6]。本研究顯示，SLE活動(dòng)期患者IFN-α水平明顯高于穩(wěn)定期患者，且IFN-α濃度與SLEDAI積分呈正相關(guān)。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示[7-8]，I型IFN受體α鏈信號(hào)通路可促進(jìn)自身抗體的產(chǎn)生及腎臟疾病的發(fā)生，而敲除I型IFN受體α鏈基因可阻止NZB小鼠及NZM 2328小鼠疾病進(jìn)展，降低溶血性貧血的發(fā)生率，提高小鼠存活率。另外，干擾素調(diào)節(jié)因子5(interferon regulatory factor 5，IRF5)是SLE患者IFN-α產(chǎn)生相關(guān)基因，其表達(dá)與I型IFN的活性及抗dsDNA抗體的產(chǎn)生密切相關(guān)[9]。本研究也觀察到抗dsDNA抗體陽(yáng)性患者血清IFN-α水平高于抗dsDNA抗體陰者，血紅蛋白減低及血液系統(tǒng)損害患者血清IFN-α水平高于正常者。同時(shí)，IFN-α水平與抗dsDNA抗體呈正相關(guān)、與血紅蛋白水平負(fù)相關(guān)，以上結(jié)果與先前文獻(xiàn)報(bào)道共同說(shuō)明了IFN-α在SLE疾病發(fā)生發(fā)展中的重要性。

在對(duì)SLE細(xì)胞因子的研究中，另外兩個(gè)較為重要的細(xì)胞因子IL-6、TNF-α也已得到廣泛共識(shí)。SLE是典型的輔助T細(xì)胞2(T help cell 2，Th2)細(xì)胞因子介導(dǎo)的自身免疫性疾病，其中IL-6是一種重要的Th2細(xì)胞因子。IL-6可由多種細(xì)胞分泌產(chǎn)生，并且影響多種細(xì)胞的功能。其中最重要的作用是促進(jìn)細(xì)胞的活化與分化，參與T、B淋巴細(xì)胞等細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)[10]。多項(xiàng)研究顯示，SLE患者血清中IL-6水平顯著升高，且與疾病活動(dòng)度、血清抗dsDNA抗體呈正相關(guān)[5,11-12]。另有研究報(bào)道，狼瘡腎炎患者尿液中IL-6水平明顯升高，且與血清抗dsDNA抗體滴度相關(guān)[13]。本研究也顯示，SLE患者外周血IL-6水平明顯升高，且抗dsDNA抗體陽(yáng)性患者水平明顯高于抗dsDNA抗體陰性患者，同時(shí)IL-6水平與抗dsDNA抗體呈正相關(guān)。研究中發(fā)現(xiàn)，SLE患者血清IL-6水平與血沉呈明顯正相關(guān)，而在IFN-α、TNF-α卻未發(fā)現(xiàn)此關(guān)系，說(shuō)明IL-6可反映機(jī)體的慢性炎性狀態(tài)。在對(duì)血清IL-6與SLE臨床癥狀的相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn)，血清IL-6水平與發(fā)熱、關(guān)節(jié)炎及血液系統(tǒng)損害有顯著的相關(guān)性。由于IL-6可由多種細(xì)胞分泌產(chǎn)生，可引起包括急性時(shí)相蛋白和發(fā)熱等多種效應(yīng)，因此本研究觀察到在伴有發(fā)熱的患者血清IL-6水平明顯高于無(wú)發(fā)熱患者。此外，發(fā)熱、關(guān)節(jié)炎、白細(xì)胞或血小板減少是SLE疾病活動(dòng)度評(píng)估指標(biāo)，而多項(xiàng)研究已證實(shí)IL-6水平與SLE疾病活動(dòng)度正相關(guān)，本研究顯示在具有以上臨床的表現(xiàn)的患者中IL-6水平明顯高于無(wú)上述癥狀的患者。

在對(duì)SLE的研究中，另外一個(gè)較為重要的細(xì)胞因子為TNF-α。與IL-6類似的是，TNF-α也可由多種細(xì)胞合成，包括T、B淋巴細(xì)胞及活化的單核巨噬細(xì)胞等。Arora等[14]報(bào)道，SLE患者血清中TNF-α水平較正常人顯著升高，認(rèn)為TNF-α在SLE發(fā)病機(jī)制中有重要的作用。然而也有觀點(diǎn)認(rèn)為，TNF-α在SLE發(fā)病中的作用是有爭(zhēng)議的[15]。在狼瘡鼠模型研究中，發(fā)現(xiàn)減少NZB/W小鼠TNF-α的產(chǎn)生可使小鼠發(fā)生腎炎，且含高水平TNF-α的小鼠疾病僅輕度活動(dòng)，認(rèn)為TNF-α缺陷是該株小鼠發(fā)生狼瘡樣改變的重要因素[16]；另有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α在MRL/lpr小鼠血清及腎臟組織中高表達(dá)，其水平與靶器官炎性程度相關(guān)[17]。本研究未發(fā)現(xiàn)SLE患者與正常對(duì)照者血清TNF-α水平明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，也未觀察到TNF-α與某種臨床表現(xiàn)明顯的相關(guān)性；僅發(fā)現(xiàn)血清TNF-α水平與IFN-α呈正相關(guān)，這可能是由于選取樣本量較少，未能使其達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義所致。但有研究報(bào)道，TNF-α 水平在穩(wěn)定期SLE患者中高于活動(dòng)期SLE患者及正常人，認(rèn)為TNF-α也可能是SLE的保護(hù)性細(xì)胞因子[18]。由于TNF-α在SLE發(fā)病機(jī)制中的作用各個(gè)研究結(jié)果不一致，仍有待于進(jìn)一步深入研究。

SLE患者體內(nèi)存在多種細(xì)胞因子的異常分泌，這些異常分泌的細(xì)胞因子是免疫細(xì)胞功能紊亂的產(chǎn)物，其可激活免疫細(xì)胞，導(dǎo)致免疫紊亂進(jìn)一步加劇。因此，深入研究SLE患者體內(nèi)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的異常，對(duì)明確SLE的發(fā)病及轉(zhuǎn)歸，指導(dǎo)SLE的治療具有重要意義。

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