姚來斌，孔保華 ，李沛軍，劉 騫，夏秀芳

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030)

食品中含有一個復(fù)雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)，由于它的化學(xué)和物理特性，很容易成為微生物繁殖的底物［1］。長期以來，人們都是通過傳統(tǒng)培養(yǎng)、分離和顯微鏡鑒定的方法來研究肉類制品中微生物的變化情況［2］，而這種傳統(tǒng)的方法并不能完全反映真正的微生物多樣性和動力學(xué)變化。研究人員推測自然界中有85%～90%的微生物至今還不能被培養(yǎng)［3］，這就給研究帶來了困難。在近十年間，PCR-DGGE 技術(shù)以其可靠性強、重現(xiàn)性高、方便快捷等優(yōu)點，逐漸取代了肉類制品中菌相變化研究的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法。該技術(shù)可以用來研究不同微生物之間的差異，也可以分析相同微生物不同儲藏時期的變化情況［4］。

1 PCR-DGGE 概述

20 世紀80 年代，由Fischer 和Lerman［5-6］提出一種快速檢測DNA 片段點突變的技術(shù)，即變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)技術(shù)。1993 年Muyzer 等［7］在研究微生物的遺傳多樣性和菌群差異方面利用了該技術(shù)的優(yōu)點，首次將該技術(shù)應(yīng)用到微生物的菌相變化研究中。近幾年，PCR-DGGE技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到了肉類及肉制品的菌相變化研究中。

DGGE 可以將長度相同而序列不同的DNA 片段分離開。該技術(shù)基本原理是［8-9］:雙鏈DNA 分子因其內(nèi)部核苷酸的排列順序不同而具有不同的解鏈溫度。在含有不同變性梯度變性劑(尿素、甲酰胺)的聚丙烯酰胺凝膠中，不同分子量的雙鏈DNA 分子進行電泳時會有不同的解鏈溫度，DNA 序列的不同會導(dǎo)致不同的解鏈速度和程度。當(dāng)雙鏈DNA 分子遷移到凝膠的特定位置并達到適宜的解鏈溫度時，就會開始部分解鏈。同時，DNA 分子的遷移速度與其解鏈程度成反比，從而會使不同的DNA 片段在凝膠的不同位置停留，最后形成分離開的不同帶譜。理論上來說，只要電壓、變性梯度、電泳時間等條件選取適當(dāng)時，所有存在差異的DNA 片段都可以被分離開。

DNA 分子是由A、T、G、C 四種堿基構(gòu)成。其中G、C 堿基結(jié)合的力比A、T 堿基要大，所以G、C 堿基含量多的DNA 分子就會有越高的解鏈溫度。因此，我們將“GC 夾板”(GC-clamp)技術(shù)應(yīng)用到PCRDGGE 中，人工制造一個高溫解鏈區(qū)域，即將一段含有較多G、C 堿基的DNA 堿基片段人工添加到待解鏈的DNA 雙鏈一端，因此不同的DNA 就會由于不同的解鏈溫度而實現(xiàn)較精確的分離［10-11］。

DGGE 技術(shù)主要的操作步驟［12］:前期預(yù)處理樣本;提取和純化樣本DNA(或RNA);對樣本中16S rRNA 基因或基因片段的PCR(或RT-PCR)擴增反應(yīng);DGGE 反應(yīng)過程中條件的優(yōu)化;制備凝膠;樣本的DGGE 分析;DGGE 圖譜的分析;條帶序列分析。

2 PCR-DGGE 技術(shù)的優(yōu)越性

2.1 經(jīng)濟、快速、準確地動態(tài)檢測食品中的微生物

在非培養(yǎng)狀態(tài)下直接提取樣品中微生物的DNA，隨后進行PCR 擴增，得到DGGE 圖譜，在DGGE 中得到不同微生物的分離條帶［4］，每一個獨立的條帶都代表一個物種。隨后經(jīng)過割膠、測序等步驟，就可以在基因庫中和已知微生物的序列進行對比，達到快速檢測微生物的目的。

Muyzer 等［7］用PCR-DGGE 方法檢測出了數(shù)量占群落總數(shù)1%的微生物。Omar 等［13］經(jīng)過大量實驗證實PCR-DGGE 技術(shù)的微生物檢測極限為1%～3%，如果同時結(jié)合rRNA 雜交技術(shù)，還可以將檢測極限降低至0.1%左右。DGGE 技術(shù)可以根據(jù)實際需要，對食品生產(chǎn)和儲藏等環(huán)節(jié)做出準確、快速的菌群多樣性和動態(tài)檢測［14］。同時，DGGE 技術(shù)可以同時分析多個樣本，尤其是食品發(fā)酵過程中微生物的變化情況。所以該技術(shù)在研究自然界微生物群落的遺傳多樣性和種群差異方面具有明顯的優(yōu)勢，并且可以應(yīng)用到食品的微生物研究中。

2.2 能與其他多種方法結(jié)合

PCR-DGGE 技術(shù)可以與多種方法結(jié)合，以達到準確認識微生物的組成、菌相的變化等目的。實際上，結(jié)合其他方法(如傳統(tǒng)平板培養(yǎng)、雜交技術(shù)、克隆測序技術(shù)等)以后，PCR-DGGE 技術(shù)將會成為菌群多樣性和菌相動態(tài)變化研究的有力工具，從而提供微生物群體變化和多樣性等信息。

3 PCR-DGGE 技術(shù)的缺點

3.1 樣品制備過程中存在微生物污染

雖然PCR-DGGE 技術(shù)有著明顯的優(yōu)點，但是其中也存在不足。在實驗過程中，前期清洗、混勻、冷凍、離心或培養(yǎng)階段都會使樣品感染微生物，而使測量結(jié)果中鑒定出多余菌種。DNA 的提取過程中也會因為空氣中微生物的影響而導(dǎo)致DNA 的提取不夠精確，從而影響提取的濃度和檢測限［15］。

3.2 食品成分越復(fù)雜，DNA 抽提就越困難

由于食品中含有蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物、鹽類等成分，這就會導(dǎo)致雜質(zhì)的去除存在困難，DNA 的抽提也會更復(fù)雜。這些雜質(zhì)會成為后續(xù)實驗步驟的阻礙，所以在進行PCR 擴增之前要對提取的DNA 進行純化。

3.3 產(chǎn)生優(yōu)先擴增現(xiàn)象

1992 年Reysenbach 發(fā)現(xiàn)在進行PCR 擴增時，rDNA 基因存在優(yōu)先擴增的現(xiàn)象，導(dǎo)致部分的DNA不能被擴增，因此不能真實反映原菌落結(jié)構(gòu)。在擴增過程中還會產(chǎn)生嵌合體和異源雙鏈，從而影響DGGE 圖譜的分析［16］。

3.4 DNA 分離及測序的局限性

DGGE 只能分離較小的DNA 片段(1kb 以下)，這就限制了菌種的分析量，導(dǎo)致一些菌種不能被鑒定出來［17］。同時，有些微生物有多個操縱子，使DGGE 圖譜中出現(xiàn)多個同種微生物的條帶，從而導(dǎo)致微生物多樣性被過高估計。若實驗條件不適宜，則不能完全分開有序列差異的DNA 片段，產(chǎn)生DNA 共同遷移的現(xiàn)象。

4 PCR-DGGE 技術(shù)在食品微生物菌相研究中的應(yīng)用

4.1 發(fā)酵食品

發(fā)酵食品是利用有益微生物進行加工制造的一類營養(yǎng)食品。同時，發(fā)酵食品很容易被微生物污染，其中的微生物多種多樣，并且在不同發(fā)酵時期微生物的動態(tài)變化也不同。分子生物學(xué)的發(fā)展給發(fā)酵過程中菌相變化的研究提供了一個有力工具。通過DGGE 方法研究后發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵食品在發(fā)酵期間和成熟期間的主要優(yōu)勢菌是清酒乳桿菌(Lactobacillus sakei)和彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)，同時還伴有木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)。

4.1.1 發(fā)酵香腸 Kesmen 等［18］使用傳統(tǒng)培養(yǎng)和獨立于培養(yǎng)的分子學(xué)方法鑒定了一種土耳其發(fā)酵腸中的乳酸菌的菌落結(jié)構(gòu)。一方面，使用PCR-DGGE 的方法來對微生物16S DNA 的V1 和V3 區(qū)域進行分析。另一方面，使用細菌基因組重復(fù)序列PCR 技術(shù)(rep-PCR)對16S rDNA 和16S～23S rDNA 基因間隔區(qū)域進行分析，之后對微生物進行主要的區(qū)分和菌株的分組。最后通過PCR-DGGE 分析，鑒定到了8種不同的乳酸菌。

Lu 等［19］研究了發(fā)酵腸接種不同初始菌之后的變化情況，鑒定中使用了傳統(tǒng)培養(yǎng)和非培養(yǎng)的方法。起初接種了香腸乳桿菌(Lactobacillus farciminis)和腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)的香腸，在兩種鑒定方法中發(fā)現(xiàn)，都可以對微生物有比較有效的抑制作用。在接種不同初始微生物的發(fā)酵香腸中，前兩天內(nèi)的pH 并沒有很大的差別。

4.1.2 發(fā)酵乳制品 傳統(tǒng)西西里羊奶酪和實驗室制作的羊奶酪之間品質(zhì)有所差異，并且添加初始菌種不同也會導(dǎo)致不同的風(fēng)味。Randazzo 等［20］針對兩種奶酪進行了實驗，分別向原料奶和巴氏殺菌后的奶中添加初始菌種，隨后分析不同奶酪樣品中微生物的多樣性和動態(tài)變化。PCR-DGGE 分析結(jié)果顯示，兩種奶酪中微生物的數(shù)量和分類十分相似，其中的菌株主要包括嗜熱鏈球菌 (Streptococcus thermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)和糞腸球菌(Enterococcus faecalis)。傳統(tǒng)方法和分子學(xué)方法比較之后發(fā)現(xiàn)，兩種奶酪的優(yōu)勢菌也基本相似。

4.1.3 發(fā)酵谷物 大醬是韓國傳統(tǒng)的發(fā)酵型豆瓣醬，由于含有豐富的蛋白質(zhì)而被韓國人推崇。Kim等［21］分析了5 個工廠制作大醬產(chǎn)品和5 個家庭大醬制作產(chǎn)品。對微生物16S rRNA 基因V3 區(qū)域進行的DGGE 圖譜結(jié)果顯示，在大醬中乳酸菌(Lactic acid bacteria)和屎腸球菌(Enterococcus faecium)是主要的菌種，而被人們認為是主要優(yōu)勢菌的芽孢桿菌(Bacillus)在檢測中并沒有發(fā)現(xiàn)。然而使用針對于芽孢桿菌的特殊引物來進行選擇性PCR 擴增時，在一些大醬樣品中鑒定到了枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。利用DGGE 的方法，在不同的大醬樣本中都檢測出了微生物的多樣性，并且DGGE 圖譜的聚類分析還揭示了大醬產(chǎn)品中微生物的動態(tài)變化情況。

Leite 等［22］使用傳統(tǒng)培養(yǎng)和PCR-DGGE 的方法來研究三種不同的巴西谷物中微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性。PCR-DGGE 結(jié)果顯示在三種谷物中，馬乳酒樣乳桿菌(Lactobacillus kefiranofaciens)和高加索酸奶乳桿菌(Lactobacillus kefiri)是主要的微生物，并且菌落的產(chǎn)生主要是依靠釀酒酵母的作用。

4.1.4 發(fā)酵酒類 Mills 等［23］通過對比葡萄酒發(fā)酵過程中酵母的多樣性和動態(tài)變化，證明非啤酒酵母的生長受發(fā)酵溫度的影響。通過對PCR 擴增反應(yīng)中獲得的26S rDNA 基因進行DGGE 分析之后，證實在發(fā)酵過程中假絲酵母一直存在。發(fā)酵后期假絲酵母的條帶仍然存在，但是非啤酒酵母的含量明顯降低。

4.1.5 其他發(fā)酵制品 橄欖鮮果儲藏一段時間后會被乳酸菌感染，最終導(dǎo)致不能食用。Randazzo 等［24］評價了發(fā)酵過程中橄欖表面菌群數(shù)量的動態(tài)變化，同時在不同發(fā)酵過程中接種了不同劑量和種類的初始菌。平板培養(yǎng)結(jié)果顯示在培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)了不同濃度的微生物，并且揭示了初始乳酸菌的有益作用，它會抑制腸道桿菌(Enterobacteriaceae)的生長。此外，DGGE 結(jié)果顯示鹽水條件的改變沒有增加李斯特菌(Listeria)的生長。

4.2 非發(fā)酵食品

4.2.1 肉類制品 伊比利亞火腿表面經(jīng)常會出現(xiàn)和微生物有關(guān)的“黑斑”，人們長久以來都不清楚是何種微生物導(dǎo)致了這種現(xiàn)象。Andrade 等［25］針對微生物16S rRNA 進行分析，使用分子學(xué)方法對火腿的“黑斑現(xiàn)象”進行了研究。在后鹽階段前期，分離到了幾個微生物菌株，然而只有一個菌株是與“黑斑”的產(chǎn)生有關(guān)，對這個菌株的16S rRNA 進行檢定后發(fā)現(xiàn)，它是假單胞菌(Pseudomonas sp.)。

Hu 等［26］使用16S rDNA-DGGE 系統(tǒng)發(fā)育分析的方法揭示了切片真空包裝火腿在4℃儲藏的過程中微生物的動態(tài)變化和主要的腐敗菌。該研究從火腿中直接提取微生物總DNA 后，先使用了傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法，隨后用巢式PCR 和降落式PCR 的方法對16S rDNA 的V3 可變區(qū)域進行了擴增，最后使用DGGE圖譜分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)清酒乳桿菌(Lactobacillus sakei)和彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)是主要優(yōu)勢菌。

牛肉經(jīng)常被腐敗菌污染而導(dǎo)致其貨架期縮短，所以了解牛肉儲藏過程中微生物的種類和動態(tài)變化就顯得尤為重要。Ercolini 等［27］鑒定了牛肉冷藏過程中導(dǎo)致腐敗的微生物菌種，并且研究了使用抗菌包裝對于牛肉儲藏的意義。他們使用含有乳酸鏈球菌素(Nisin)、鹽酸(HCl)和乙二胺四乙酸(EDTA)混合溶液組成的抗菌包裝，并且將此包裝應(yīng)用到切片牛肉中。此后，監(jiān)測包裝中與腐敗相關(guān)的優(yōu)勢菌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用抗菌包裝會對一些革蘭氏陽性細菌起到很好的抑制作用，比如肉食桿菌(Carnobacteria)、乳酸菌(Lactic acid bacteria)和熱死環(huán)絲菌(Brochotrix thermosphacta)。與對照組相比，它們的生長在至少前11 天都得到了控制。這些微生物的鑒定是使用PCR-DGGE 對直接從肉中提取的DNA 的16S rRNA 基因的分析得到的。與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法進行比較后發(fā)現(xiàn)，改變儲藏條件，主要的微生物菌種并沒有改變，只是數(shù)量上有了差別。

Li［28］使用傳統(tǒng)平板培養(yǎng)結(jié)合DGGE 技術(shù)的方法研究了豬胴體剝皮和非剝皮兩種工藝過程中菌相的動態(tài)變化，以及不同儲藏條件、時間對微生物多樣性的影響。以屠宰和儲藏過程中微生物的總DNA 為模板，對16S rDNA 的V6～V8 區(qū)進行PCR 擴增，顯示出了不同屠宰過程中微生物的不同菌落結(jié)構(gòu)。研究證明，使用不同的屠宰工藝會對豬肉中微生物的多樣性帶來影響。同時對冷卻豬肉在不同儲藏條件下菌相的變化進行了研究，DGGE 結(jié)果表明，氧氣充足的儲藏過程中主要優(yōu)勢菌為:熱死環(huán)絲菌(Brochothrix thermosphacta)，莫拉氏菌(Moraxella sp.)，氣單胞菌 (Aeromonas sp.)，假單胞菌(Pseudomonas sp.)，葡萄球菌(Staphylococcussp)和節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)。

Han 等［29］研究了高壓對切片火腿中腐敗微生物的抑制作用，分別使用了傳統(tǒng)培養(yǎng)和PCR-DGGE 方法。為了準確描述菌落結(jié)構(gòu)和壓力處理之后的優(yōu)勢菌，所以將平板分離出的細菌總DNA 和直接從火腿中提取的總RNA，分別進行PCR-DGGE 分析和16S rDNA 的V3 可變區(qū)域的RT-PCR-DGGE。DGGE 圖譜結(jié)果分析顯示，切片火腿高壓處理過程中存在的微生物有多種，但是乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp.lactis)得到了明顯的抑制。然而高壓處理后，綠色魏斯氏菌(Weissella viridescens)和魏斯氏菌(Weissella)依然存在，并且成為最后的腐敗菌。

Russo 等［30］研究了肉類產(chǎn)品腐敗微生物中熱死環(huán)絲菌的變化情況。收集肉上散落的微生物之后，直接提取DNA，PCR 擴增之后用于DGGE 分析。經(jīng)過測序發(fā)現(xiàn)，主要的腐敗微生物為熱死環(huán)絲菌(B.thermosphacta)，假單胞菌(Pseudomonas spp)，腸桿菌(Enterobacteriaceae)和乳酸菌(Lactic acid bacteria)。本項研究中發(fā)現(xiàn)隨著儲藏時間的延長，熱死環(huán)絲菌的減少是因為乳酸菌的存在。

孫彥雨等［31］對儲藏了0、3、5、7、9 天的冰鮮雞進行微生物多樣性研究，通過提取雞肉中菌種的總DNA，通過使用PCR-DGGE 技術(shù)，將微生物的16S rDNA(V6～V8 區(qū)域)的PCR 擴增片段割膠測序，最后鑒定樣品中的微生物群落，同時和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的結(jié)果進行了對比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，初始階段存在數(shù)量較多的菌種不一定是最后導(dǎo)致腐敗的優(yōu)勢菌，其中導(dǎo)致雞腿肉和雞胸肉腐敗的菌種有一定區(qū)別，在低溫低氧分壓環(huán)境中存活的微生物會導(dǎo)致最終的腐敗。傳統(tǒng)平板培養(yǎng)方法和PCR-DGGE 得到的導(dǎo)致腐敗的優(yōu)勢菌不完全相同。

4.2.2 魚類制品 Hovda 等［32］研究了養(yǎng)殖的大西洋鱈魚在氣調(diào)包裝后菌群的變化。PCR-DGGE 結(jié)果顯示氧氣濃度較高的包裝中假單胞菌(Pseudomonas spp.)成為了主要優(yōu)勢菌，而CO2/N2和空氣包裝中，主要腐敗微生物是發(fā)光桿菌(Photobacterium sp.)，腐敗希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)和假單胞菌(Pseudomonas spp.)。同時Hovda［33］還對氣調(diào)包裝中的比目魚進行了PCR-DGGE 研究，分析了不同氣體濃度的氣調(diào)包裝中優(yōu)勢菌的變化情況。

4.2.3 其他食品 Dina 等［34］針對農(nóng)場大批散裝奶和工廠生產(chǎn)的奶分別使用DGGE 和克隆的方法進行了微生物群落的研究。兩種方法均顯示，在冷藏條件下微生物的多樣性有所下降。牛奶在冷藏之后，假單胞菌(Pseudomonadales)成為了優(yōu)勢菌。農(nóng)場的樣品和工廠的樣品間微生物的組成有所不同，前者以革蘭氏陽性細菌為主，包括梭狀芽孢桿菌(Clostridia)和放線菌(Actinobacteria)，后者主要是革蘭氏陰性細菌。盡管假單胞菌(Pseudomonadales)在原料奶長期冷藏之后成為主要腐敗菌，但是放線菌(Actinobacteria)的出現(xiàn)，成為了評價牛奶品質(zhì)的主要微生物。

5 PCR-DGGE 技術(shù)的應(yīng)用前景

長久以來，人們都是通過傳統(tǒng)平板培養(yǎng)的方法來研究食品中菌相的多樣性和動態(tài)變化。由于傳統(tǒng)的方法在操作過程中會引入污染菌，同時只有少部分的微生物可以模擬自然生長環(huán)境進行培養(yǎng)基培養(yǎng)。

分子生物學(xué)方法是一個快速崛起的技術(shù)，用它來鑒定食品中的微生物系統(tǒng)是其中的一個分支。使用分子學(xué)技術(shù)來研究食品中菌相變化是對傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的有力補充，這樣會讓我們更準確、全面、快速的認識微生物在食品中的動態(tài)變化。

PCR-DGGE 技術(shù)由于檢測速度快、可靠性高、重現(xiàn)性強等特點逐漸被人們接受。雖然PCR-DGGE技術(shù)還不夠成熟，操作過程中可能會產(chǎn)生優(yōu)先擴增和異源雙鏈等現(xiàn)象，但是現(xiàn)階段已經(jīng)通過巢式PCR和降落式PCR 將影響降低到最低限度，今后該技術(shù)將會成為研究食品中菌相變化的最有力手段之一。

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