陳 輝，于 剛，高瑞昌，吳燕燕，戚 勃，馬海霞，陳勝軍，*

(1.江蘇大學(xué)，江蘇鎮(zhèn)江212013;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東廣州510300)

透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，HA)是一種糖胺聚糖，在人體內(nèi)廣泛分布，大于50%的HA 分布在人體的皮膚、肺、腸道中，在血液、關(guān)節(jié)滑液、臍帶中也有分布［1］，其為人體的正常生理活動發(fā)揮著重要作用，如影響細胞的增殖和分化［2］、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、潤滑關(guān)節(jié)、調(diào)節(jié)血管壁的通透性、創(chuàng)傷修復(fù)等［3］;HA 是目前為止發(fā)現(xiàn)的最好的天然保水劑，在皮膚保水方面發(fā)揮著重要的作用。自從哥倫比亞大學(xué)教授Meyer 等人［4］于1934 年首次從牛眼玻璃體中分離獲得透明質(zhì)酸以來，有關(guān)透明質(zhì)酸的研究一直生生不息，透明質(zhì)酸也因其優(yōu)良的性質(zhì)在食品、醫(yī)學(xué)、生物等方面獲得廣泛的應(yīng)用，目前開發(fā)新的HA 產(chǎn)品成為熱門的研究趨勢。早期用來提取HA 的主要為臍帶，但由于原材料獲取困難，使得生產(chǎn)成本增加，同時感染病毒的陸生生物組織提取的HA 通常含有一些病原菌，使得產(chǎn)品的安全性存在問題，因此研究利用相對安全的水生生物組織作為提取HA 的原料具有較大的實際價值，雖然從不同原料、采用不同的制備方法獲得的HA 分子量不同，但都有著相似的分子結(jié)構(gòu)、無種屬差異、無抗原性，這為水生生物透明質(zhì)酸的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)［5］。目前用于提取HA 的水生生物組織主要有魚眼玻璃體［6］，蛙皮［7］、魚體粘液、淡水蚌肉汁水等。孫智華等人［8］研究利用泥鰍粘液提取透明質(zhì)酸，理化性質(zhì)分析表明提取物含有氨基己糖、已糖醛酸，利用紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)提取物同HA 標準品的掃描圖譜完全一致;王大為等人［9］利用林蛙皮提取出高純度的HA，研究表明其保濕性好、安全性高。

1 透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)

1.1 HA 的結(jié)構(gòu)

20 世紀50 年代，卡爾·邁耶［10］實驗室闡明了透明質(zhì)酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。透明質(zhì)酸是一種高分子的聚合物，由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺通過β-1，3-糖苷鍵連接成二糖單元，然后由無數(shù)個這樣的二糖單元通過β-1，4 糖苷鍵形成無支鏈的多聚物。分子中兩種單糖的摩爾比接近1∶1，雙糖單位可達30000 之多，透明質(zhì)酸的分子量在10 萬到400 萬之間［11］。電鏡掃描顯示HA 分子為一直鏈［12］。β-1，3-糖苷鍵、β-1，4 糖苷鍵的交替存在使得HA 上的官能團均勻的分布在直鏈的兩側(cè)［13］，直鏈上的羥基定向排列，同時由于直鏈上單糖之間的羥基形成氫鍵，使得分子呈剛性的螺旋結(jié)構(gòu)，其半徑為200nm，達到一定濃度時HA 分子相互纏繞形成網(wǎng)狀三維結(jié)構(gòu)［14-15］。

1.2 HA 的理化性質(zhì)

1.2.1 物理性質(zhì) 透明質(zhì)酸溶于水，不溶于乙醇、丙酮、乙醚等有機溶劑，從水生生物組織提取的HA 為白色粉末狀。透明質(zhì)酸溶于水時，由于葡萄糖醛酸的羧基解離使其帶有負電荷，因此HA 具有酸性多糖的性質(zhì)［16］。

1.2.2 生化特性 HA 的特殊結(jié)構(gòu)賦予HA 強大的保水性能，通過氫鍵和極性鍵的作用能將水分子固定在螺旋柱中［11］，使得HA 親和的水分子相當于自身重量的1000 倍［7］，HA 的保水能力隨著分子量的增大而增大，從水生生物提取的HA 分子量通常較大，因此其保水性能相對較好。

HA 水溶液具有特異的流變學(xué)性質(zhì)，擁有良好的粘彈性，其粘彈性大小取決于HA 的分子量和溶液濃度，分子量越大、濃度越高粘彈性越好［7］，合理的改變HA 的分子量和溶液濃度均能獲得較好的粘彈性。除此之外，溶液的pH、溫度、離子強度也會對HA 溶液的粘彈性造成較大影響。透明質(zhì)酸是非牛頓性流體，具有假塑性。

1.2.3 降解反應(yīng) HA 的分子量具有很大的分散性，天然HA 的分子量分布為105～107u。水生生物來源HA 分子量通常較大［6-7］，可以將其降解，形成分子量為1 × 104～5 × 105u 的 低 分 子 量 透 明 質(zhì) 酸(LMWHA)［17］。LMWHA 具有高分子量HA 不具備的生物活性，例如抗氧化［18］、免疫調(diào)節(jié)［19］、促進傷口愈合、促血管生成［20］、抗腫瘤［21］等，因此其在醫(yī)學(xué)上具有廣闊的應(yīng)用前景，近年來LMWHA 的生物活性越來越受研究者的關(guān)注。研究表明，HA 降解主要是由水解和羥基上的活性氧引起的，紫外線、超聲波［22］、γ 射線［23］均可使HA 發(fā)生降解，目前用于降解HA 的方法主要有化學(xué)法、酶法、物理法。物理法因其操作簡單、對HA 結(jié)構(gòu)破壞小、節(jié)能環(huán)保等優(yōu)點而成為研究的熱點。

Miyazaki 等人［24］研究了超聲波對HA 的降解作用，研究表明影響降解的因素主要有聲強、溫度、HA濃度、離子強度。溫度越低越有利于HA 的降解;強度越大降解效果越好，HA 分子量的變化與波強成對數(shù)關(guān)系;HA 溶液濃度過高或過低都不利于超聲對HA 的降解，應(yīng)保持一定的流動性;離子強度影響HA的空間結(jié)構(gòu)，因此其對降解也造成一定影響。

李騰飛等人［17］研究了化學(xué)-超聲聯(lián)用的方法對HA 的降解作用，首先分別單獨應(yīng)用化學(xué)法、超聲法降解HA，得到最佳降解條件分別為:使用NaClO 于4℃下降解HA、使用800kHz 和1.7MHz 雙源超聲降解HA，然后進行化學(xué)-超聲聯(lián)用法降解HA，快速降解得低分子量透明質(zhì)酸和寡糖透明質(zhì)酸，該法節(jié)能快速，獲得的HA 分子量低，可以達到實際應(yīng)用要求。

王菁等人［25］利用H2O2和抗壞血酸結(jié)合的方式對魷魚眼HA 進行降解，在適宜的條件下得到相對分子質(zhì)量為5433 透明質(zhì)酸;代瓊等人［26］從魷魚眼提取出純度較高的HA，然后采用H2O2和抗壞血酸結(jié)合的方式將其進行降解，并對HA 降解前后的性質(zhì)進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HA 降解前后都具有保濕性和抗氧化性，且表現(xiàn)出分子量相關(guān)性。

2 提取方法

目前應(yīng)用于制備HA 的方法有組織提取法、微生物發(fā)酵法、人工合成法，水生生物透明質(zhì)酸的提取主要采用組織提取法。

組織提取法的一般流程為:預(yù)處理、浸提、鹽析、去蛋白、脫色、季銨鹽絡(luò)合、解離、醇沉、干燥。提取法優(yōu)點在于工藝流程簡單，獲得的HA 分子量較大，一般都大于60 萬，溶液粘度高，保濕性能好，但在動物組織中HA 通常與蛋白質(zhì)結(jié)合，且組織中含有其他多糖類物質(zhì)，給HA 的提取帶來不便［27］，因此高效、經(jīng)濟的去蛋白、分離純化技術(shù)成為研究的重點之一。

組織提取法主要包括:水提取法、中性鹽鹽提取法，近年來，隨著多糖類物質(zhì)的深入研究，新的提取分離手段也在不斷的被引進和嘗試，目前針對水生生物中透明質(zhì)酸的存在方式而提出的提取方法還有超聲波、酶提取法等，新方法的引入為水生生物透明質(zhì)酸的提取、應(yīng)用帶來了廣闊的前景。

2.1 中性鹽提取法

無機鹽的加入可以解除水生生物組織中透明質(zhì)酸與蛋白質(zhì)的絡(luò)合，從而利于透明質(zhì)酸溶解在水中，且適量鹽濃度可以使蛋白質(zhì)鹽析，從而減少提取液中雜質(zhì)蛋白質(zhì)的含量、提高HA 的濃度。但該法提取率較低，且引入新的雜質(zhì)。孫智華等人以泥鰍粘液組織為原料，用10%的氯化鈉溶液提取得到粗提液，加入氯仿初步去除蛋白質(zhì)，然后進行酶解，之后采用醇沉、季銨鹽絡(luò)合法進一步純化，最終的產(chǎn)品得率為1.96%，核酸含量＜0.35%，蛋白質(zhì)含量＜0.54%［8］。

2.2 酶提法

酶能水解蛋白質(zhì)、核酸等雜質(zhì)，此外，酶能解除HA 和蛋白質(zhì)之間的作用，利于水生生物HA 的提取，因此酶提法獲得的產(chǎn)品蛋白質(zhì)、核酸等雜質(zhì)少，提取效率高。

目前研究較多的酶有中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶。由于提取原料的不同，各種酶對其的作用效果也有差異，張麗媛等人比較了中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶對金烏賊眼透明質(zhì)酸的提取效果，結(jié)果表明中性蛋白酶提取效果最佳，利用該酶提取的粗提液經(jīng)三氯乙酸去蛋白、季銨鹽絡(luò)合、乙醇沉淀純化后HA 的提取率為10.70%［28］;盧佳芳等人利用枯草桿菌蛋白酶在酶用量4%，酶解溫度60℃的條件下酶解1h 提取魷魚眼透明質(zhì)酸，粗品提取率為14.10%，用D101 大孔吸附樹脂進行脫色，通過超濾除去小分子雜質(zhì)，最后利用DEAE -Sephadex A-25 離子交換柱分步洗脫得到HA-1、HA-2兩種組分，HA-2 占89.60%［27］。

合適的pH、溫度、時間不僅可以使酶發(fā)揮最佳的水解功效而且可以有效防止HA 的降解，汪建等人報道了將pH 控制在8～9，利用粗胰蛋白酶水解原材料，經(jīng)硅藻土過濾、乙醇沉淀得HA，收率為0.4%～0.6%，平均分子質(zhì)量4.0 ×105～1.0 ×106，蛋白質(zhì)含量為5%～15%，葡萄糖醛酸為20%～28%［29］。梁天佐等人［30］報道當溫度達到50℃時，透明質(zhì)酸就會發(fā)生較大的降解。謝鎮(zhèn)等人［31］報道了利用胰蛋白酶提取透明質(zhì)酸，最適溫度為45℃，此時提取率最高，HA 的分子量損失率也較少。

3 透明質(zhì)酸的純化

3.1 蛋白質(zhì)的去除

透明質(zhì)酸的提取過程中蛋白質(zhì)是主要的雜質(zhì)成分，蛋白質(zhì)的去除效果直接影響HA 的質(zhì)量和應(yīng)用，因此必須去除蛋白質(zhì)，常用的蛋白質(zhì)去除方法有:加熱法、三氯乙酸法、等電點法、氯仿法、Sevage 法。

加熱法操作簡單，但去除蛋白質(zhì)效果不佳，不能完全去除蛋白質(zhì)，同時高溫下長期操作會引起透明質(zhì)酸的降解，因此一般很少采用。三氯乙酸法操作簡便、作用條件溫和、一般不會引起透明質(zhì)酸的降解，但蛋白質(zhì)的去除效果不理想，一般達不到行業(yè)標注的要求。

3.1.1 等電點法 蛋白質(zhì)為兩性分子，溶液處于等電點時蛋白質(zhì)的溶解度最低，因此將pH 調(diào)節(jié)到蛋白質(zhì)的等電點則會使蛋白質(zhì)沉淀，從而分離純化透明質(zhì)酸，研究表明透明質(zhì)酸提取液雜質(zhì)蛋白質(zhì)的等電點一般為4～5，因此經(jīng)常將pH 調(diào)節(jié)到4～5 以去除蛋白質(zhì)。等電點法操作簡便、蛋白質(zhì)去除效果好、對產(chǎn)品的破壞小。姚美琴等人發(fā)現(xiàn)當pH 為4 時溶液蛋白質(zhì)含量最少，因此其將提取原液pH 調(diào)節(jié)至4，靜置一段時間，可以去除大部分蛋白質(zhì)，然后利用超濾法除去小分子多肽類，產(chǎn)品的得率為2.96%，純度為72.21%，葡萄糖醛酸為33.5%、蛋白質(zhì)為3.06%［32］。但不同的蛋白質(zhì)等電點不同，該法并不能完全去除蛋白質(zhì)，高向東等人將HA 粗品溶解之后過濾，然后利用氫氧化鈉和鹽酸溶液將HA 溶液pH 反復(fù)調(diào)節(jié)至10～10.5 和6～6.5 以使不同的蛋白質(zhì)沉淀，獲得了理想的蛋白質(zhì)去除效果，產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量只有0.04%，葡萄糖醛酸含量為47.2%［33］。

3.1.2 氯仿法 氯仿可以使蛋白質(zhì)變性沉淀，從而可以用來純化HA，多余的氯仿可以利用乙醇去除，溶劑殘留量低、蛋白質(zhì)去除效果較好［34］。此外氯仿處理可以除去致炎物質(zhì)，不但能防止提取過程中提取液的腐敗而且能提高產(chǎn)品的安全性。但該法純化時透明質(zhì)酸的損失較大，且氯仿等有機溶劑對透明質(zhì)酸有一定的破壞作用，可能影響HA 的生理活性，加上其操作繁瑣、耗時長等原因使其不適于工業(yè)化生產(chǎn)。高向東等人［33］研究發(fā)現(xiàn)氯仿法可以使產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量降低到0.69%，但HA 的回收率只有57.1%;郭學(xué)平等人［34］報道了利用胰蛋白酶水解雞冠提取HA，將得到的粗品溶解，加入少量的氯仿防腐，再加入兩倍體積的氯仿去除蛋白質(zhì)，結(jié)合鏈霉蛋白酶酶解、季銨鹽絡(luò)合、乙醇沉淀精制HA，得到的HA達到藥用級的要求。

3.1.3 Sevage 法 一般加入提取液1/5 體積的氯仿，然后加入1/5 氯仿體積的正丁醇，混合均勻后劇烈振搖20～30min 形成乳化液，此時蛋白質(zhì)發(fā)生變性，溶液呈膠狀，去除水層和溶劑層交界處的變性蛋白即可純化HA［32］。該法反應(yīng)溫和，對多糖的結(jié)構(gòu)影響不大，為多糖純化時常用的去除蛋白質(zhì)方法，但每次去除變性蛋白質(zhì)時會有多糖的損失，且該法效率較低，往往重復(fù)多次才能達到理想效果，同時其不能去除和多糖結(jié)合的蛋白質(zhì)。李知敏等人利用Sevage 法去除蛋白質(zhì)4 次，效果仍比不上三氯乙酸法，且多糖的損失率高達42.3%［35］。

3.2 透明質(zhì)酸的精制純化

目前用于分離透明質(zhì)酸的方法多種多樣，文獻報道的有季銨鹽法、乙醇沉淀法、離子交換層析法、凝膠層析法、過濾法、超濾法等。

3.2.1 季銨鹽絡(luò)合法 目前經(jīng)常用的季銨鹽有CPC［36］(氯代十六烷基吡啶)、CPB(溴代十六烷基吡啶)、CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)，季銨鹽在水溶液中帶正電荷，而HA 在水溶液中帶負電荷，兩者在低濃度的鹽溶液中絡(luò)合形成沉淀，在高濃度的鹽溶液中沉淀又發(fā)生解離，形成游離的透明質(zhì)酸，從而達到透明質(zhì)酸的分離純化的目的。該法能除去不和季銨鹽絡(luò)合的雜質(zhì)，效果好，得到的產(chǎn)品純度一般較高［7］。因CTAB 法生產(chǎn)成本較CPB、CPC 絡(luò)合法低，故其逐步成為研究的熱點，劉麗等人［37］報道利用CTAB 絡(luò)合法結(jié)合乙醇沉淀法純化HA 提取液，先向提取液中加入15%CTAB 溶液于35℃下沉淀2h，然后用70%乙醇于4℃下沉淀，HA 收率可達96.62%，蛋白去除率達86.09%。梁天佐等人［30］利用乙醇沉淀法結(jié)合CPC 絡(luò)合法純化HA，其得率為92.1%，該法獲得的產(chǎn)品達到了化妝品級的要求。

3.2.2 乙醇沉淀法 向溶液中加入乙醇使得其極性發(fā)生變化，從而導(dǎo)致透明質(zhì)酸的溶解度降低。乙醇沉淀法純化透明質(zhì)酸的效果與原液中透明質(zhì)酸的濃度有關(guān)，當HA 濃度為1%～2%時沉淀效果最好，濃度太大時沉淀不完全，濃度太低乙醇耗量太大;乙醇用量一般為溶液體積的2～3 倍;乙醇的濃度對HA 的得率也有較大影響，隨著乙醇濃度的增加HA 的得率增加。丁霞等人［38］研究指出使用2 倍及2 倍以上的乙醇能將HA 從溶液中沉淀出來，損失少，且保證溶液中一定的鹽濃度有利于HA 的沉淀，產(chǎn)品中多余的鹽可以采用透析法去除。醇沉?xí)r可先將pH 調(diào)節(jié)到一定值，這樣有利于HA 的沉淀，李潤等人［39］將pH調(diào)節(jié)到堿性，使得立即產(chǎn)生沉淀，沉淀完全后調(diào)回中性，防止HA 降解。

3.2.3 物理方法 目前研究較多的物理純化方法有離子交換層析、微濾、超濾、透析、過濾法等。

離子交換層析法是常規(guī)的制備較高純度HA 的方法，但成本較高、操作復(fù)雜、有些材料還需要對樹脂進行修飾［40］。故一般用于醫(yī)用級透明質(zhì)酸的生產(chǎn)。葉華等人［41］報道了選用201 ×7 陰離子交換樹脂填柱，進行雙濃度洗脫得到了醫(yī)用級HA;微濾、超濾一般用來去除提取液中的小分子物質(zhì)，超濾還可以用來濃縮提取液從而減少乙醇的用量，減少生產(chǎn)成本，也有報道指出將微濾和超濾結(jié)合作為主純化技術(shù)來純化透明質(zhì)酸，周海東等人［42］利用PVDF 材質(zhì)的膜分離純化發(fā)酵液，用微濾去除菌體，超濾去除蛋白質(zhì)及其他小分子物，實現(xiàn)HA 的分離提純;過濾法一般用來獲得澄清的提取液，過濾法生產(chǎn)成本低，操作簡單，且對HA 的破壞較少，因此有一定的應(yīng)用前景，盛瑞堂等人［43］提出了用過濾法分離純化透明質(zhì)酸的工藝，結(jié)合超濾、乙醇結(jié)晶得到的產(chǎn)品葡萄糖醛酸含量達44.2%，蛋白質(zhì)含量為0.01%，收率高達90.5%。

4 展望

HA 是一種極具市場開發(fā)潛力的生物產(chǎn)品，隨著人們生活水平的提高以及人們對健康的追求，我國HA 的市場需求也隨之增大，我國是水產(chǎn)大國，合理開發(fā)漁業(yè)資源成為漁業(yè)發(fā)展的重要課題，利用水生生物生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)透明質(zhì)酸必然成為其中重要一項。

以水生生物為原料生產(chǎn)的透明質(zhì)酸分子量大，具有優(yōu)良的吸水保水性能，為其在化妝品的應(yīng)用提供了廣闊的前景。但天然提取的HA 溶解速度快、吸收迅速、在組織停留時間短，這給HA 的進一步利用帶來麻煩，因此對HA 的改性、降解以及在食品、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究成為現(xiàn)在和將來的研究重點。

［1］Oh E J，Park K，Kim K S，et al.Target specific and longacting delivery of protein，peptide，and nucleotide therapeutics using hyaluronic acid derivatives［J］.Journal of Controlled Release，2010，141(1):2-12.

［2］Kogan G，?oltés L，Stern R，et al.Hyaluronic acid:a natural biopolymer with a broad range of biomedical and industrial applications［J］.Biotechnology Letters，2007，29(1):17-25.

［3］Kakehi K，Kinoshita M，Yasueda S.Hyaluronic acid:separation and biological implications ［J］ .Journal of Chromatography B，2003，797(1):347-355.

［4］Meyer K，Palmer J W.The polysaccharide of the vitreous humor［J］.Journal of Biological Chemistry，1934，107 (3):629-634.

［5］魯念慈，譚天偉.透明質(zhì)酸的制備及其應(yīng)用［J］.功能高分子學(xué)報，2001，14(3):370-376.

［6］Murado M A，Montemayor M I，Cabo M L，et al.Optimization of extraction and purification process of hyaluronic acid from fish eyeball［J］.Food and Bioproducts Processing，2012，90(3):491-498.

［7］沙坤.中國林蛙皮透明質(zhì)酸提取技術(shù)的研究［D］.吉林:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

［8］孫智華，張照瑞.泥鰍粘液中透明質(zhì)酸的制備及其理化性質(zhì)的研究［J］.藥物生物技術(shù)，2001，8(1):42-44.

［9］王大為，張艷榮，沙坤.中國林蛙皮多糖類天然保濕因子的提取與鑒定［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2002，24(6):99-102.

［10］Weissmann B，Meyer K.The Structure of Hyalobiuronic Acid and of Hyaluronic Acid from Umbilical Cord1，2［J］.Journal of the American Chemical Society，1954，76(7):1753-1757.

［11］潘紅梅.透明質(zhì)酸的研究現(xiàn)狀綜述［J］.四川食品與發(fā)酵，2003，39(1):5-9.

［12］Fessler J H，F(xiàn)essler L I.Electron microscopic visualization of the polysaccharide hyaluronic acid［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1966，56(1):141

［13］Atkins E，Sheehan J K.Structure for hyaluronic acid［J］.Nature，1972，235(60):253-254.

［14］Liu L，Liu D，Wang M，et al.Preparation and characterization of sponge-like composites by cross-linking hyaluronic acid and carboxymethylcellulose sodium with adipic dihydrazide［J］.European polymer journal，2007，43(6):2672-2681.

［15］陳永浩.透明質(zhì)酸發(fā)酵法制備及其復(fù)合改性研究［D］.無錫:江南大學(xué)，2010.

［16］崔媛，段潛，李艷輝.透明質(zhì)酸的研究進展［J］.長春理工大學(xué)學(xué)報，2011，34(3):101-106.

［17］李騰飛.低分子量透明質(zhì)酸超聲—化學(xué)制備的基礎(chǔ)及實驗研究［D］.重慶:重慶大學(xué)，2011.

［18］Trabucchi E，Pallotta S，Morini M，et al.Low molecular weight hyaluronic acid prevents oxygen free radical damage to granulation tissue during wound healing［J］.International journal of tissue reactions，2002，24(2):65.

［19］Knoflach A，Azuma H，Magee C，et al.Immunomodulatory functions of low-molecular weight hyaluronate in an acute rat renal allograft rejection model［J］.Journal of the American Society of Nephrology，1999，10(5):1059-1066.

［20］胡星，王軍，韋峰，等.小分子量透明質(zhì)酸促進星形膠質(zhì)細胞中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和血管內(nèi)皮生長因子的表達［J］.中國組織工程研究，2012，16(28):5216-5221.

［21］Ghatak S，Misra S，Toole B P.Hyaluronan oligosaccharides inhibit anchorage - independent growth of tumor cells by suppressing the phosphoinositide 3 - kinase/Akt cell survival pathway［J］.Journal of Biological Chemistry，2002，277(41):38013-38020.

［22］Park S N，Park J C，Kim H O，et al.Characterization of porous collagen/hyaluronic acid scaffold modified by 1-ethyl-3-(3 - dimethylaminopropyl)carbodiimide cross - linking［J］.Biomaterials，2002，23(4):1205-1212.

［23］Kim J K，Srinivasan P，Kim J H，et al.Structural and antioxidant properties of gamma irradiated hyaluronic acid［J］.Food Chemistry，2008，109(4):763-770.

［24］Miyazaki T，Yomota C，Okada S.Ultrasonic depolymerization of hyaluronic acid［J］.Polymer Degradation and Stability，2001，74(1):77-85.

［25］王菁，楊佳玉，金淼，等.魷魚眼透明質(zhì)酸降解工藝條件研究［J］.食品科學(xué)，2009，30(24):238-241.

［26］代瓊，楊文鴿，陳小芳，等，魷魚眼透明質(zhì)酸及其降解產(chǎn)物的抗氧化和保濕作用［J］.食品科學(xué)，2012，33(01):35-38.

［27］盧佳芳，魷魚眼中透明質(zhì)酸的提取、降解及其生物活性研究［D］.寧波:寧波大學(xué)，2010.

［28］張麗媛，李和生，孫楠楠，等.響應(yīng)面法優(yōu)化金烏賊眼透明質(zhì)酸的提取工藝［J］.食品科學(xué)，2011，32(22):114-118.

［29］汪建，汪清，謝鎮(zhèn).酶解條件控制對透明質(zhì)酸工業(yè)化提取的影響［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2010，41(1):20-23.

［30］梁天佐.微生物發(fā)酵法產(chǎn)透明質(zhì)酸工藝研究［D］.保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［31］謝鎮(zhèn)，汪建.雞冠透明質(zhì)酸工業(yè)化生產(chǎn)中質(zhì)量影響因素分析［J］.中國生化藥物雜志，1993(4):19-22.

［32］姚美琴，褚俊杰，陳小娥.魷魚眼透明質(zhì)酸的提取工藝研究［J］.食品科技，2009，34(5):241-244.

［33］虞菊萍，高向東.透明質(zhì)酸精制方法的比較［J］.藥學(xué)與臨床研究，2007，15(4):300-302.

［34］郭學(xué)平，凌沛學(xué)，王春喜，等.透明質(zhì)酸的生產(chǎn)［J］.藥物生物技術(shù)，2000，7(1):61-64.

［35］李知敏，王伯初，周菁，等.植物多糖提取液的幾種脫蛋白方法的比較分析［J］.重慶大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2004，27(8):57-59.

［36］Amagai I，Tashiro Y，Ogawa H.Improvement of the extraction procedure for hyaluronan from fish eyeball and the molecular characterization［J］.Fisheries Science，2009，75(3):805-810.

［37］劉麗.透明質(zhì)酸菌株發(fā)酵條件優(yōu)化、制備及應(yīng)用研究［D］.北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2010.

［38］丁霞.透明質(zhì)酸的生物合成及其純化［D］.南京:南京理工大學(xué)，2004.

［39］李潤，查五一.羊眼透明質(zhì)酸制備工藝的改進［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1999，30(7):289-291.

［40］倪杭生，李潤，賀艷麗，等.透明質(zhì)酸的離子交換層析純化［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2001，32(11):485-488.

［41］劉驥翔，葉華，蘇海佳，等.離子交換層析純化透明質(zhì)酸［J］.生物加工過程，2009，4(7):32-35.

［42］周海東，倪晉仁，黃文，等.膜技術(shù)分離透明質(zhì)酸發(fā)酵液可行性研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，31(11):46-51.

［43］盛瑞堂，孫猛，譚天偉.過濾法分離純化透明質(zhì)酸［J］.過程工程學(xué)報，2006，6(2):285-288.