申可佳，尤昭玲

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南 長沙 410208）

中醫(yī)藥能促進卵泡發(fā)育成熟，改善卵巢功能和卵母細胞質(zhì)量，輔助提高妊娠率，這些療效通過長期臨床實踐已得到肯定，但作用機制未完全闡明。以往的研究多集中在補腎中藥對卵巢相關(guān)細胞因子及受體表達的影響、對性腺軸激素及受體的調(diào)節(jié)等方面，關(guān)于這些被調(diào)節(jié)的因素最終通過何種分子機制產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)不甚明了。細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是指細胞接受外源信號，將其轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)信號，最終調(diào)節(jié)特定基因表達的過程。卵巢內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路非常復(fù)雜，包括G蛋白介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、蛋白酪氨酸激酶（PTK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、蛋白絲/蘇氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等，現(xiàn)已證實轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）超家族/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是調(diào)控卵泡發(fā)育的重要途徑[1-2]。本文綜合近年文獻，首先總結(jié)TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對卵泡發(fā)育的調(diào)控，然后分析目前中藥對此通路的干預(yù)作用，希望能對中藥作用機制的研究有所啟發(fā)和幫助。

1 卵巢內(nèi)的TGF-β超家族/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

TGF-β超家族/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路屬于蛋白絲/蘇氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，由TGF-β超家族、TGF-β超家族受體和Smads蛋白家族三部分組成。

TGF-β超家族 轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）超家族是一組結(jié)構(gòu)相關(guān)、功能多樣的細胞因子家族，主要包括TGF-β、激活素（Activin）、骨形成蛋白（BMP）、生長分化因子（GDF）等，它們參與調(diào)節(jié)哺乳動物的多種生理活動，在卵泡的發(fā)育中也起著重要作用[3-4]。

1.1 轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）

多種組織細胞可合成TGF-β，以自分泌或旁分泌方式調(diào)節(jié)細胞的生長和分化。目前發(fā)現(xiàn)至少有5個亞型，分別為TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5，各亞型在許多生物反應(yīng)中表現(xiàn)出相似的作用。其中TGF-β1所占比例最高（＞90%），活性最強，是一種多功能的細胞活性調(diào)節(jié)因子，在胚胎發(fā)生、脂肪形成、肌肉形成、軟骨形成、骨發(fā)生、上皮細胞分化、纖維發(fā)生以及免疫細胞的功能調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用[5]。

1.2 激活素（activin）、抑制素（inhibin）、卵泡抑素（follistatin）即ACT-INH-FS

ACT-2NH-FS系統(tǒng)均為TGF-β超家族成員，主要由垂體和卵巢顆粒細胞分泌。抑制素有抑制素A（INHA）及抑制素B（INHB）2種化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的亞型，兩者均可選擇性反饋抑制垂體促卵泡素（FSH）的合成和分泌，在卵泡募集和優(yōu)勢卵泡的選擇中起作用。激活素有激活素A（ACTA）、激活素B（ACTB）和激活素AB（ACTAB）3種亞型，為抑制素的同源或異源二聚體（激活素A：βAβA，激活素B：βBβB）及異源二聚體（激活素AB：βAβB），其作用與抑制素相反，可以促進垂體FSH分泌，調(diào)節(jié)顆粒細胞的分化，激活素A還有促進卵泡發(fā)育的作用。卵泡抑素（FS）是激活素的結(jié)合蛋白，通過與激活素的不可逆結(jié)合間接抑制FSH的合成與分泌，對抗激活素對卵泡的作用。目前認為ACT-INHFS作為一個系統(tǒng)，通過內(nèi)分泌途徑對垂體FSH的合成和分泌進行反饋調(diào)節(jié)，并在卵巢局部通過自分泌或旁分泌的途徑，調(diào)節(jié)卵泡膜細胞和顆粒細胞對促性腺激素的反應(yīng)性，故此系統(tǒng)與卵泡的發(fā)育密切相關(guān)，是參與卵泡發(fā)育的主要的卵巢內(nèi)部因子[6-9]。

1.3 抗苗勒氏管激素（AMH）

AMH是TGF-β超家族成員之一，參與卵泡的發(fā)育過程。AMH在始基卵泡中無表達，在竇前卵泡和小竇卵泡（直徑≤4 mm）的顆粒細胞中高表達，在4～8 mm卵泡中表達量逐漸下降，而在8 mm以上的竇卵泡中AM H表達消失，在閉鎖卵泡中亦無表達。目前發(fā)現(xiàn)AMH主要通過抑制始基卵泡發(fā)育的起始及抑制卵泡對FSH的敏感性這兩方面來抑制卵泡發(fā)育，并且發(fā)現(xiàn)AMH是預(yù)測卵巢儲備功能和卵巢反應(yīng)性的良好指標之一[10-11]。

1.4 骨形成蛋白（BMP）

目前的研究已發(fā)現(xiàn)BMP有10多種亞型，由不同的細胞在卵泡發(fā)育的不同階段分泌，比如BMP-15是卵母細胞來源的因子，動物實驗研究證明其能調(diào)控周圍顆粒細胞的分裂，對正常卵母細胞發(fā)育及生殖功能具有重要的影響[12]。BMP-6可由卵母細胞和顆粒細胞分泌，目前認為可能與優(yōu)勢卵泡形成后的卵泡閉鎖相關(guān)。顆粒細胞還能分泌BMP-2和BMP-3，有研究顯示BMP-2重組體可以增強綿羊顆粒細胞中的FSH引導(dǎo)的雌激素（E2）和抑制素A的產(chǎn)生， 刺激抑制素B亞組mRNA的表達以及體外培養(yǎng)的人類粒層黃體細胞中抑制素B蛋白的產(chǎn)生。BMP-3在卵巢中的生化作用還不清楚。已有發(fā)現(xiàn)大鼠的卵泡膜細胞可以產(chǎn)生BMP-3b、BMP-4和BMP-7，其中BMP-4和-7的重組體可以通過促進FSH誘導(dǎo)的E2的生成和抑制孕酮的生物合成來調(diào)控FSH的信號傳導(dǎo)[13]。

1.5 生長分化因子（GDF）

GDF-9 和GDF-9B主要在人類和其他哺乳動物的卵巢表達，GDF-9是卵泡正常生長發(fā)育必需的細胞因子，它通過自分泌方式促進卵母細胞進行有絲分裂，通過旁分泌的方式調(diào)節(jié)顆粒細胞和卵泡膜細胞的增殖分化，同時影響卵巢內(nèi)類固醇激素、蛋白酶及其他細胞因子的分泌[14]。GDF-9B可能通過和GDF-9共同作用來調(diào)節(jié)顆粒細胞的功能， 比如促性腺激素誘導(dǎo)的增生和分化[13-14]。

選取2017年3月～2018年5月我院內(nèi)接診的帶狀皰疹神經(jīng)痛患者82例作為研究對象，按照治療措施的差異將其分為兩組。其中，對照組男20例，女21例，年齡22～55歲，平均（56±1.44）歲，體質(zhì)量70～85 kg，平均（80.44±1.25）kg；觀察組男15例，女26例，年齡21～55歲，平均（50.85±1.79）歲，體質(zhì)量72～85 kg，平均（80.44±1.12）kg。對比分析兩組患者一般資料，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2 TGF-β超家族受體[5,15-16]

TGF-β超家族受體通過與配體（TGF-β超家族）的結(jié)合及活化，啟動Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。目前共發(fā)現(xiàn)8種受體，即受體Ⅰ（TβRⅠ），受體Ⅱ（TβRⅡ），受體Ⅲ（TβRⅢ），受體Ⅳ（GH3），Endoglin，PLBPs（含有可結(jié)合TGF-β1和TGF-β2的兩種受體），GI-210。其中研究得比較清楚的為TβRⅠ、TβRⅡ和TβRⅢ，這3種受體具有較高的同源性，且TβRⅠ和TβRⅡ 均為具有絲氨酸／蘇氨酸激酶活性的Ⅰ型跨膜糖蛋白，分為細胞外配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)絲-蘇氨酸蛋白激酶區(qū)。

2.1 TβRⅠ又稱為活化素樣蛋白激酶（Alks），可分為Alk5、Alk3和Alk1三個亞群。

Alk5亞群包括TGF-βⅠ型受體Alk5、激活素受體Alk4和Nodal受體Alk7；Alk3亞群包括BMPⅠ型受體Alk3和Alk6；Alk1亞群包括同BMP /GDF和TGF-β/Activin作用的Alk1和Alk2。TβRⅠ的C端含有一個保守的Gs結(jié)構(gòu)域（Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly），是接受TβRⅡ磷酸化激活的部位，具有傳遞信號的作用。

2.2 TβRⅡ 包括TGF-βRⅡ，Activin RⅡ，Activin RⅡB，BMP /GDFⅡ型受體（BMP RⅡ），AMH的Ⅱ型受體（M IS RⅡ）。

2.3 TβRⅢ 亦稱為β烯糖，無信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)，但可提高配體對TβRⅡ的親和力。

3 Smads蛋白家族[5,17-18]

Smads蛋白家族是目前已被證實和公認的TGF-β超家族受體作用的底物，能將從TGF-β獲得的信息傳遞到細胞核內(nèi)。Smads家族的蛋白結(jié)構(gòu)具有高度的同源性，一級結(jié)構(gòu)由三部分組成：高度保守的氨基端即MH1區(qū)、高度保守的羧基端即MH2區(qū)以及富含脯氨酸的連接區(qū)。在介導(dǎo)TGF-β超家族信號時，MH1區(qū)發(fā)揮與DNA結(jié)合的作用，MH2結(jié)構(gòu)域可調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。

根據(jù)Smads蛋白在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的不同作用可將其分為3類：（1）受體激活型Smads（receptor-activated Smads）或途徑限制型（pathway-restricted Smad）：即R- Smads，包括Smad 1、2、3、5、8、9、10。其中Smad 1、5、8、9參與BMP的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，Smad2、3 參與TGF-β和Activin的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而Smad10主要參與激活BMP 拮抗劑（神經(jīng)誘導(dǎo)及發(fā)育的關(guān)鍵因子）與成纖維細胞生長因子（FGF）的活性。（2）共同介質(zhì)型或通用型Smads：即co-Smads，包括Smad4，有1個富含脯氨酸的Smad4活化區(qū)，是激活依賴Smad蛋白的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所必需的。Smad4可以與所有已活化的R-Smads結(jié)合，是BMP、TGF-β和Activin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的共同通路。（3）抑制型Smads：即I-Smads，包括Smad6、7，可拮抗R-Smads介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，形成控制TGF-β超家族作用的負反饋環(huán)路。

4 卵巢內(nèi)TGF-β超家族信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[5,7,11,13-18]

TGF-β超家族成員（配體）在細胞外先與TβRⅢ形成復(fù)合物，再被傳遞給處于自動磷酸化的TβRⅡ，或配體直接與TβRⅡ結(jié)合形成二元復(fù)合物，隨后磷酸化激活TβRⅠ，形成三元/二元復(fù)合物，使TβRⅠ在靶細胞內(nèi)與膜受體偶聯(lián)的GS區(qū)活化，并與之形成信號復(fù)合物，隨后激活R-Smads蛋白MH2區(qū)的受體磷酸化位點（SSXS基序）。活化的R- Smads與co-Smads即Smad4形成異多聚體， 然后進入細胞核中，通過Smad4和Smad3的M H1區(qū)與DNA上的Smad結(jié)合元件松散結(jié)合，在局部一些轉(zhuǎn)錄共激活因子和／或共抑制因子的影響下，MH2區(qū)的轉(zhuǎn)錄激活序列與靶基因形成緊密結(jié)合，最終實現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。I-Smads不能被受體磷酸化，但可競爭性地與活化的TβRⅠ牢固結(jié)合，阻止R-Smads的磷酸化，從而負反饋控制TGF-β信號的強度和持續(xù)時間。

4.1 Smad2/Smad3介導(dǎo)的通路

已證實TGF-β、Ac tiv in、GDF-9可通過細胞內(nèi)Smad2/Smad3的介導(dǎo)完成信號傳遞。

4.1.1 GDF-9來源于卵母細胞和顆粒細胞，通過自分泌和旁分泌方式作用于靶細胞（卵母細胞、顆粒細胞和卵泡膜細胞）的BMP RⅡ，再激活受體Alk5，隨后激活靶細胞內(nèi)Smad2/ Smad3，活化的Smad2/Smad3與Smad4形成多聚體，進入核內(nèi)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。目前已發(fā)現(xiàn)GDF-9可以引起顆粒細胞的透明質(zhì)酸合成酶2（Has2）、環(huán)氧化酶2（Cox2）和類固醇生產(chǎn)的敏感調(diào)節(jié)蛋白（StAR） mRNA的表達， 而抑制尿激酶型纖溶酶原激活物（uPa）和黃體化激素受體（LHR）的表達。

4.1.2 ACT、INH、FS來源于卵巢顆粒細胞，在卵巢內(nèi)部通過自分泌和旁分泌方式作用于顆粒細胞、卵泡膜細胞和卵母細胞，其中ACT作用于靶細胞的activin RⅡ，再激活受體Alk4，隨后激活靶細胞內(nèi)Smad2/Smad3，并與Smad4形成多聚體，進入核內(nèi)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。目前發(fā)現(xiàn)ACT可調(diào)節(jié)顆粒細胞的分化， 并且和卵泡的發(fā)育階段相關(guān)。體外培養(yǎng)未分化的大鼠顆粒細胞發(fā)現(xiàn)ACT可促進其表達芳香化酶、促卵泡素（FSH）和黃體生成素（LH）受體， 刺激雌二醇（E2）和孕酮（P）的分泌，并且上述作用不依賴于FSH，但可被FSH增強。同時，ACT促進顆粒細胞INH的基礎(chǔ)分泌和FSH誘導(dǎo)的分泌及其INH亞單位的表達。INH、FS的信號通路暫未明確。

4.1.3 TGF-β由卵母細胞和卵泡膜細胞產(chǎn)生，作用于顆粒細胞、卵泡膜細胞和卵母細胞的TGF-βRⅡ，再激活受體Alk5，接下來的細胞內(nèi)信號途徑同GDF-9。

4.2 Smad1/ Smad5/ Smad8介導(dǎo)的通路

已證實BMP、AMH可通過細胞內(nèi)Smad1/ Smad5/ Smad8的介導(dǎo)完成信號傳遞。

4.2.1 BMP 卵母細胞分泌BMP-15和BMP-6，顆粒細胞分泌BMP-2、BMP-3、BMP-6、BMP-7，卵泡膜細胞分泌BMP-3、BMP-4、BMP-7，這些亞型均可通過旁／自分泌作用于靶細胞的BMP RⅡ，然后激活受體Alk2，Alk3和Alk6，活化的受體在磷酸化激活細胞內(nèi)Smad1/ Smad5/ Smad8，后者與Smad4形成多聚體，進入核內(nèi)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。不同亞型引起的生物學(xué)效應(yīng)見前述（1.4）。

4.2.2 AMH由卵巢顆粒細胞表達，作用于顆粒細胞和卵泡膜細胞的MISRⅡ，然后激活受體Alk2，Alk3和Alk6，接下來的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑同BMP。

5 中醫(yī)藥對卵巢內(nèi)TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的干預(yù)及思考

細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是非常復(fù)雜的過程，涉及胞外配體、跨膜受體、胞內(nèi)各種信使分子等，機體某種生理和病理現(xiàn)象的產(chǎn)生往往涉及眾多的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，且多條通路錯綜復(fù)雜，譬如卵泡的發(fā)育，是眾多細胞因子和激素（胞外配體）通過多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來調(diào)控的，很多過程還未弄清楚。所以選取一條研究得比較成熟、已得到公認的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路很關(guān)鍵，TGF-β超家族/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)就是目前已被證實的、和卵泡發(fā)育密切相關(guān)的通路。以往文獻報道的大部分研究集中在中醫(yī)藥對卵巢內(nèi)TGF-β超家族（配體）的調(diào)節(jié)，如對ACT-INH-FS、AMH、BMP、TGF-β1等的調(diào)節(jié)，對受體和胞內(nèi)信號分子的研究較少，對細胞內(nèi)Smads蛋白的干預(yù)研究更是鳳毛麟角，如孫麗萍等[18]報道四物合劑通過升高小鼠卵巢顆粒細胞P-Smad2/3的表達以維持芳香化酶表達水平的正常，維持卵巢的正常分泌功能，對卵巢形態(tài)和顆粒細胞增殖亦有保護性作用，對于臨床防治化療性卵巢早衰具有一定的可行性。崔瑞琴等[19]報道菟絲子黃精顆粒劑可干預(yù)和修復(fù)雷公藤多苷所致雌鼠卵巢損傷，其機制是菟絲子、黃精可以促進被雷公藤多苷所抑制的卵巢組織中Smad4 mRNA的表達。雖然中醫(yī)藥干預(yù)卵巢細胞內(nèi)Smads蛋白的文獻很少，但已發(fā)現(xiàn)較多中醫(yī)藥干預(yù)骨質(zhì)疏松癥骨組織和下丘腦等部位TGF-β/Smad轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究[20-23]，這些研究為中藥對卵巢內(nèi)TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的干預(yù)揭開冰山一角，啟發(fā)我們從新的角度闡明中醫(yī)藥干預(yù)卵泡發(fā)育的機制。

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