郭國財,王 超,姚維成
(青島大學(xué)附屬醫(yī)院,山東青島266000)
納米羥基磷灰石(nHAP)是一種優(yōu)質(zhì)的醫(yī)用生物材料,除具有羥基磷灰石(HAP)良好的生物活性及組織相容性外,還有其特性,特別是廣譜的抗癌作用。人腦膠質(zhì)瘤是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤,病死率、復(fù)發(fā)率高。本文綜述nHAP在膠質(zhì)瘤治療中的應(yīng)用進展。
膠質(zhì)瘤預(yù)后差,近年來發(fā)病率有上升的趨勢。有資料顯示,膠質(zhì)母細胞瘤經(jīng)確診后1年生存率為30%左右,平均生存期53周左右,手術(shù)及放化療后,平均生存期也僅為 14.6 個月左右[1,2]。目前,惡性腦膠質(zhì)瘤的標(biāo)準治療方案是手術(shù)爭取全切后輔以放療和化療。惡性腦膠質(zhì)瘤因其浸潤彌漫性生長,或位置深在,或累及重要功能區(qū),往往不能被完全切除。而且,由于多數(shù)膠質(zhì)瘤細胞的基因特性和血腦屏障(BBB)的存在,使放療和化療效果差。近年來,大量的輔助治療方法如基因治療、免疫治療及靶向治療等被應(yīng)用,并且取得了一定的療效。
HAP是一種含有氫氧化物離子的磷酸鈣鹽,是人體骨、牙齒無機物的主要成分。HAP與人體骨骼晶體結(jié)構(gòu)基本一致,為六方晶系,呈弱堿性,微溶于水,易溶于酸,難溶于堿。HAP是一種強離子交換劑,分子中的鈣離子容易被鎘、汞、鍶、鋇等金屬離子置換,還可與含有羧基的氨基酸、蛋白質(zhì)、有機酸等發(fā)生反應(yīng)。HAP的許多特性與其粒徑大小和晶體形態(tài)密切相關(guān)。
nHAP表現(xiàn)出更優(yōu)越的性能。nHAP具有溶解度高、均勻分散良好、吸附性強和生物親和性等特質(zhì),有更好的生物活性、組織相容性和化學(xué)穩(wěn)定性。大量的生物相容性研究已證實,nHAP無毒、無刺激、不導(dǎo)致過敏反應(yīng)、不導(dǎo)致溶血、不導(dǎo)致突變、不破壞生物組織,能與骨形成牢固的化學(xué)結(jié)合,已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)用生物材料領(lǐng)域,如硬組織修復(fù)材料、藥物及基因載體等。
Sun等[3]采用液相沉淀法合成nHAP微晶作為抗癌藥物載體,在體外細胞培養(yǎng)實驗中意外發(fā)現(xiàn),nHAP微晶明顯抑制Ca-9癌細胞的增殖,而且,他們還發(fā)現(xiàn)nHAP微晶體能夠吸附阿霉素(ADM)、氟尿嘧啶(5-FU)、絲裂霉素C(MMC)等抗腫瘤藥物,作為它們的載體,而ADM和載有ADM的HAP(ADMHAP)對癌細胞均有抑制作用,且后者明顯優(yōu)于前者[4]。多項研究[5~8]已證實,nHAP 能夠抑制人白血病、骨肉瘤、惡性黑色素瘤、肝癌等多種癌細胞的增殖。目前,研究發(fā)現(xiàn)nHAP抗腫瘤作用的機制可能有以下幾個方面。
3.1 nHAP作為化療藥物、基因治療的載體nHAP顆粒小、無毒、無免疫原性、有良好的組織相容性、生物黏附性強,可吸附藥物量大并且能結(jié)合、運載大分子藥物,可對插入其中的DNA片斷有很好的保護作用,是一種良好的藥物或基因載體,能夠攜帶抗腫瘤藥物或放射性元素殺滅腫瘤細胞。Itokazu等[9]報道,ADM-HAP作用于骨肉瘤細胞效果較好,ADM緩慢釋出可顯著延長藥物作用時間,能更有效地抑制癌細胞增殖。nHAP可將蛋白類藥物或DNA、RNA等基因治療分子包裹或吸附在其表面,同時也可在顆粒表面偶聯(lián)特異性的靶向分子,比如特異性配體、單克隆抗體等,通過靶向分子與細胞表面的特異性受體結(jié)合,經(jīng)細胞吞飲進入細胞內(nèi),實現(xiàn)安全有效的靶向藥物治療或基因治療[10]。
3.2 nHAP作用于細胞膜 正常狀態(tài)下細胞內(nèi)Ca2+維持在低水平,腫瘤細胞比正常細胞有更強的鈣攝入能力。nHAP作用于細胞膜,可導(dǎo)致過多的Ca2+攝入,增加細胞內(nèi)Ca2+濃度,使細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡,激活細胞內(nèi)的Ca2+/Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶,使 DNA 降解、細胞凋亡[11]。
3.3 nHAP作用于細胞內(nèi)溶酶體 腫瘤細胞較正常組織細胞有更高的吞噬活性。nHAP溶膠易被吞噬進入細胞,與初級溶酶體結(jié)合形成次級溶酶體,在其內(nèi)降解產(chǎn)生游離酸或者其他細胞毒性產(chǎn)物,導(dǎo)致溶酶體破裂及酶的釋放,從而啟動溶酶體的凋亡途徑,抑制腫瘤生長或直接破壞細胞膜的通透性,導(dǎo)致細胞腫脹、破裂、死亡[12]。
3.4 nHAP影響核酸合成 張建平等[13]采用單細胞凝膠電泳技術(shù),檢測nHAP對大鼠乳腺癌細胞系Walker256的 DNA損傷作用,發(fā)現(xiàn) nHAP可導(dǎo)致DNA鏈形成缺口,阻礙核酸合成,并且作用強度與劑量呈正相關(guān)。
3.5 nHAP誘導(dǎo)細胞周期阻滯與凋亡 研究發(fā)現(xiàn),nHAP可能抑制微管、微絲的形成,使癌細胞分化受阻于G2期,并推測,假如nHAP與G2期時相敏感抗癌藥合用,會有化療增敏作用[14]。p53、p21、c-myc等基因和Caspase等是調(diào)節(jié)細胞凋亡的重要基因,它們控制細胞DNA損傷的應(yīng)答時序,協(xié)調(diào)應(yīng)答過程,通過調(diào)節(jié)DNA復(fù)制、阻斷細胞周期或促進細胞凋亡等程序,引起諸多相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[15]。p53是一類重要的抑癌基因,主要在G1/S期起控制點作用,它決定細胞是否啟動DNA合成。p53蛋白可上調(diào)p21(細胞周期依賴的蛋白激酶抑制劑)表達,阻止細胞分裂,并給細胞提供足夠的時間來修復(fù)損傷。c-myc是另一個使細胞由G1期向S期過渡的必要的早期應(yīng)答基因。研究發(fā)現(xiàn)[7],nHAP能夠上調(diào)p53表達,下調(diào)c-myc表達,使細胞周期阻滯于G1期。
3.6 nHAP影響端粒酶的活性 端粒酶活性表達是諸多惡性腫瘤獲得無限制生長能力中很重要的環(huán)節(jié)。端粒酶的主要功能是維持染色體末端的端粒序列,維持染色體的穩(wěn)定性,抵消因細胞分裂所致的端粒DNA損耗,起到抑制腫瘤細胞的作用。nHAP有抑制腫瘤細胞端粒酶基因表達和下調(diào)端粒酶活性的作用[16]。
目前,腦膠質(zhì)瘤的主要治療方法是手術(shù)切除,輔以放化療。但是,腦膠質(zhì)瘤的基因特性決定了其對放射治療不敏感。而且,血腦屏障(BBB)使絕大多數(shù)小分子化合物和幾乎所有的大分子物質(zhì)不能進入腦病變區(qū),也削弱了化療藥物對腦膠質(zhì)瘤的療效。
納米粒子轉(zhuǎn)運藥物不需要開放BBB,允許幾乎所有的藥物被轉(zhuǎn)運入腦細胞內(nèi),且不需要對藥物本身進行修飾;另外,還可用納米控釋系統(tǒng)使藥物緩慢的釋放,維持長時間腦血管藥物濃度,提高療效。沈維高等[17]將負載Stat3 shRNA的nHAP作用于鼠膠質(zhì)瘤C6細胞,發(fā)現(xiàn)其顯著抑制腫癌生長。因此,推測nHAP有望成為腦膠質(zhì)瘤基因、化學(xué)藥物治療的良好載體。
nHAP 本身具有廣譜抗癌作用。田昂等[18,19]應(yīng)用電化學(xué)沉積法在鈦合金表面制備nHAP涂層,與人腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U87細胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)nHAP涂層能夠很好地抑制U87細胞的增殖,證實了nHAP對膠質(zhì)瘤具有抑制作用,并且nHAP的不同形態(tài)對U87細胞增殖有不同的抑制作用,其中針狀結(jié)構(gòu)抑制作用最強。
研究證實,nHAP只能與TLR+4的單核細胞相互作用。Toll樣受體(TLRs)為Ⅰ型跨膜受體,用來識別和傳導(dǎo)先天性和適應(yīng)性的免疫反應(yīng)信號,通過以核因子-κB(NF-κB)為主的刺激信號的級聯(lián)反應(yīng)信號傳導(dǎo)通路,激活多種靶基因,導(dǎo)致細胞因子的釋放和協(xié)同刺激因子的表達。膠質(zhì)瘤是起源于膠質(zhì)細胞的神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,膠質(zhì)細胞在神經(jīng)系統(tǒng)中行使單核細胞的功能。膠質(zhì)瘤細胞本身可以表達TLRs[19],這為nHAP作用于膠質(zhì)瘤并通過TLRs進行信號傳導(dǎo)提供了理論依據(jù),其機制可能涉及TLR4受體的調(diào)控表達[19]。
TLR4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的炎性受體,能夠啟動細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),通過NF-κB和c-Jun氨基末端激酶(JNK)/應(yīng)急激活蛋白激酶(SAPK)兩條途徑激活炎性細胞,導(dǎo)致炎性因子TNF-α、IL-6等的大量表達,觸發(fā)一系列的炎性反應(yīng),可對腫瘤細胞起到抑制作用。Grandjean-Laquerriere等研究發(fā)現(xiàn),nHAP可以誘導(dǎo) TNF-α、IL-6、IL-10和 IL-18的高表達,上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、IL-1b的高表達。但nHAP與膠質(zhì)瘤細胞TLRs的相互作用及信號傳導(dǎo)途徑還有待進一步研究。
nHAP具有很好的生物活性和生物相容性,并且能與骨形成緊密的化學(xué)結(jié)合,作為人工骨材料和組織材料已得到廣泛應(yīng)用。
郭曉東等通過Ames試驗、微核試驗、急性和亞急性毒性試驗、溶血試驗和凝血試驗,證明nHAP/PDLLA材料沒有毒性,無致突變性和刺激性,不會引起溶血和凝血。劉麗萍等給家兔靜脈注射nHAP,發(fā)現(xiàn)致死劑量或接近致死劑量的nHAP,對動物的肝腎功能及酶的影響是一過性的,各項功能均在很短時間內(nèi)恢復(fù)正常,無明顯毒性蓄積。但是,研究發(fā)現(xiàn),nHAP顆粒所組成的溶膠具有一定的不穩(wěn)定性,隨著存放時間的延長及膠體濃度的增加,nHAP顆粒會出現(xiàn)團聚現(xiàn)象,使顆粒體積增大,甚至超出納米級的范圍。當(dāng)nHAP顆粒超過毛細血管內(nèi)徑范圍時,將產(chǎn)生嚴重后果,如果廣泛栓塞肺毛細血管網(wǎng),導(dǎo)致急性呼吸功能衰竭和右心功能衰竭。
nHAP粒子溶膠的血液相容性研究結(jié)果提示,在制備nHAP粒子的時候,應(yīng)充分考慮粒子的尺寸與分散性可能帶來的生物學(xué)效應(yīng)。另外,nHAP可能會從復(fù)合材料中游離出來,并在體內(nèi)遷移,對生物體產(chǎn)生影響;或者某些成分從nHAP中游離出來,導(dǎo)致nHAP的性能改變,對生物體產(chǎn)生影響。
因此,將nHAP用作靶向藥物載體和抗腫瘤藥物前需要解決以下問題:①nHAP粒子是否容易獲得和均勻分散;②在加載藥物或蛋白質(zhì)等處理過程中,nHAP粒子的粒徑分布是否能穩(wěn)定在100 nm范圍內(nèi);③nHAP粒子不應(yīng)該對正常人體細胞產(chǎn)生毒性作用。在考慮nHAP的生物學(xué)應(yīng)用前景時,除了要考慮nHAP粒子本身的性質(zhì)外,篩選具備生物學(xué)惰性的穩(wěn)定劑、分散劑也是不可忽視的問題。
6 展望
nHAP具有特殊的物理、化學(xué)性質(zhì)及生物特性,表現(xiàn)出良好的骨誘導(dǎo)性及骨結(jié)合性,可以作為藥物載體,在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景。而且,nHAP具有廣譜抗癌作用,對多種癌細胞的增殖、生長具有抑制作用,但其抗腫瘤機制尚未研究清楚,特別是信號傳導(dǎo)及基因調(diào)控等方面。相信隨著研究的不斷深入,對nHAP性能的了解會越來越多,其安全性得以充分的評價,其用途也將越來越廣泛,定會為腦膠質(zhì)瘤的治療提供新的途徑。
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