唐玉蘭，梁慶模，莫清華，金 軍

(1衡陽市第一人民醫(yī)院，湖南衡陽421002;2南華大學附屬第一醫(yī)院)

目前，有關miRNA與結腸癌的報道較多，研究發(fā)現(xiàn)，miR-143、miR-320、miR-200c 等可通過靶向不同的靶基因抑制結腸癌細胞的生長、侵襲、轉移［1～4］。miR-124 在肝癌和宮頸癌組織中表達下調，可通過靶向CDK6抑制髓母細胞瘤細胞的生長與浸潤，也可通過靶向ITGB1抑制口腔鱗狀細胞癌的生長［5～9］。然而，關于 miR-124在結腸癌中的表達情況、生物學功能以及參與結腸癌發(fā)生發(fā)展的作用機制尚不明確。2010年9月～2012年6月，本研究采用 MTT、細胞劃痕、Transwell侵襲實驗觀察miR-124在人結腸癌SW620細胞中的生物學行為，為進一步闡明結腸癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉移的分子機制提供實驗依據(jù)，為結腸癌的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料 人結腸癌SW620細胞，來自南華大學腫瘤研究所。

1．2 方法

1．2．1 細胞培養(yǎng) 人結腸癌SW620細胞培養(yǎng)于含體積分數(shù)為10%的滅活小牛血清(BSA)RPMI 1640培養(yǎng)基(Hyclone，美國)中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱(Forma，美國)內培養(yǎng)傳代。細胞呈單層生長，鋪滿培養(yǎng)瓶后傳代;傳代時常規(guī)倒掉培養(yǎng)液，用胰蛋白酶消化;在倒置顯微鏡(Olympus，日本)下觀察，發(fā)現(xiàn)細胞質回縮，細胞間隙增大后，立即傾去胰酶，加適量含血清培養(yǎng)液吹打成單細胞懸液，按所需濃度接種。

1．2．2 細胞轉染 miR-124成熟體用于轉染后上調細胞內miR-124表達，轉染濃度為40μmol/L。接種細胞于6/96孔板或50 mL培養(yǎng)瓶中，在完全培養(yǎng)基中細胞生長至30% ～50%;在無菌EP管中，采用Lipofectamin 2000TM轉染;室溫下放置 20 min，使DNA與脂質體形成復合體，用無血清培養(yǎng)液洗滌培養(yǎng)瓶中的細胞。往復合體中加入無血清的培養(yǎng)液(不含抗生素)，溫和混勻，加入到待轉染的6/12/24/96孔板或50 mL培養(yǎng)瓶中;置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，放置24～48 h。同時，設置miR-124陰性對照。

1．2．3 細胞生長能力觀察 采用MTT實驗。培養(yǎng)轉染miRNA以及對照的細胞達到75%～80%密度時，D-Hanks液洗2遍。消化細胞，制成單細胞懸液并進行細胞計數(shù)。接種細胞于96孔板中，每孔體積200μL接種3×103個細胞，重復6孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～72 h，每孔加5 mg/mL的MTT液20μL呈色。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，終止并去除培養(yǎng)液。每孔再加入150μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物溶解。選擇490 nm波長，MTT比色，測定各孔吸光度值并記錄結果。實驗重復3次，繪制MTT曲線。

1．2．4 細胞遷移能力觀察 采用細胞劃痕實驗。將瞬時轉染miR-124成熟體和陰性對照的細胞接種于6孔板，待之長至臨近飽和。用10μL的Eppendorf Tip消毒后在細胞板上劃痕，并將細胞洗滌2～3遍。加含5%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，倒置顯微鏡下觀察24、48 h各組細胞的變化并攝像。測量各組細胞任意3個部位的不同傷口的寬度，測算0 h與12、24 h的傷口愈合率，即0 h傷口寬度與12、24 h傷口寬度的差值與0 h傷口寬度的比值。計數(shù)3組實驗的平均值，并進行統(tǒng)計分析。

1．2．5 細胞侵襲能力觀察 采用Transwell侵襲實驗。用鑷子夾住 Transwell小室浸泡在 500μL 1∶100基質膠中約5 min，取出 Transwell并晾干;將Transwell放入24孔板中，過夜干燥。在Transwell的上室內加入50μL基質膠，加入200μL無酶水/孔，直至干燥。待細胞長至80%，加入MEM培基(含5%胎牛血清)。將Tranwell預熱至37℃，每孔加入200μL侵襲緩沖液(2 mL BSA+38 mL RPMI 1640培基)，37℃放置1 h。無血清培基洗滌后消化，1 000 r/min離心5 min，收集細胞。有血清的培基重懸細胞沉淀后，1 000 r/min離心5 min，放置細胞15 min。PBS洗2次，1 000 r/min離心10 min，5 mL侵襲緩沖液重懸細胞，調整細胞數(shù)為2．5×105/mL。通過間隙加入800μL Fibronectin Solution到下腔。在上腔內加入200μL細胞懸液，在過濾器上均勻布滿后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)36～38 h。10%甲醛中固定Transwell 10 min，自來水清洗2次。將Transwell加入結晶紫中5 min，自來水清洗后放入40℃溫水泡10 min。將培養(yǎng)小室倒置晾干中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察、照相。隨機選取4個低倍視野(×100)進行細胞計數(shù)，并計算平均值。實驗結果重復3次。

1．2．6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件。實驗結果以ˉx±s表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析。P≤0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 miR-124對細胞生長能力的影響 MTT實驗檢測miR-124對人結腸癌SW620細胞生長的影響，轉染miR-124成熟體及其陰性對照24、48、72 h后，人結腸癌SW620細胞OD值分別為0．287±0．010、0．353 ±0．006、0．376 ±0．007，對照組分別為 0．436±0．014、0．551 ± 0．015、0．642 ± 0．021，P 均 ＜0．05。

2．2 miR-124對細胞遷移能力的影響 劃痕實驗檢測miR-124對人結腸癌SW620細胞運動能力影響，轉染miR-124成熟體12、24 h后傷口愈合率分別為26．5% ± 0．7%、37．7% ± 1．5%，其陰性對照分別為 40．6% ±2．5%、78．2% ±1．6%，P 均 ＜0．05。見插頁Ⅱ圖6。

2．3 miR-124對細胞侵襲能力的影響 Transwell侵襲實驗檢測miR-124對人結腸癌SW620細胞穿膜能力的影響，轉染miR-124成熟體及其陰性對照24 h后，穿過基底膜的SW620細胞數(shù)分別為(37±2．6)個和(80 ±3．6)個，P ＜0．05。見插頁Ⅱ圖7。

3 討論

結腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，在所有惡性腫瘤中發(fā)病率居第3位，且其發(fā)病率每年呈上升趨勢。全世界每年新發(fā)結腸癌大約有120萬例，我國結直腸癌的發(fā)病率和病死率增長迅速，部分城市已經(jīng)達到或超過西方發(fā)達國家水平，成為僅次于肺癌的高發(fā)惡性腫瘤［10］。目前，對于結腸癌的形成、發(fā)展、預后以及治療都有了新的認識，但要治愈和預防結腸癌的發(fā)生，關鍵問題是了解結腸癌的病因及發(fā)病機制。但是，仍然有較多的患者因為缺乏有效的治療手段而死亡，因此，很有必要進一步研究結腸癌的致癌效應并尋找出新的治療策略。

miRNA的表達失調或功能異常，可能導致包括腫瘤在內的多種疾病的發(fā)生。越來越多的研究顯示，在人類腫瘤中存在miRNA表達失調，miRNA發(fā)揮癌基因和抑癌基因的功能參與細胞增殖、凋亡和分化的調控，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的生物學功能［2，3］。Ghanta 等［11］通過自己建立的人類miRNA疾病數(shù)據(jù)庫整理出幾十個致瘤miRNA和抑瘤miRNA，并對其功能、表達、進化、基因組分布、靶基因及轉錄因子等進行了全面的系統(tǒng)生物學分析，發(fā)現(xiàn)在功能上致癌miRNA更傾向于促進細胞增殖、抑制凋亡、抑制免疫細胞發(fā)育、控制細胞周期等，而抑癌miRNA更傾向于抑制細胞生長、促進凋亡等。關于miRNA可作為癌基因或抑瘤基因參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的報道越來越多。文獻表明，miR-124在肝癌和宮頸癌組織中表達下調，miR-124可通過靶向CDK6抑制髓母細胞瘤細胞的生長與浸潤，也可通過靶向ITGB1抑制口腔鱗狀細胞癌的生長［5～8］。miR-124 與 miR-137 能促進 CD+133腫瘤干細胞的分化，抑制癌細胞的增殖，細胞周期蛋白激酶CDK6是它們的作用靶點［9］。因此，miR-124可能作為抑癌miRNA參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。鑒于此，我們在下一步的課題中，深入miR-124在結腸癌中研究將可能進一步了解結腸癌的分子病理機制。本研究結果表明，miR-124可顯著抑制人結腸癌SW620細胞生長及運動能力，過表達miR-124可顯著抑制人結腸癌SW620細胞的侵襲能力。因此，我們初步推測miR-124在結腸癌中可能發(fā)揮抑癌基因的作用。

綜上所述，miRNA作為癌基因或抑癌基因功能的發(fā)現(xiàn)為腫瘤病因及發(fā)病機制的研究提供了新思路，也為腫瘤預防及腫瘤分型、診斷、預后判斷、指導用藥、療效監(jiān)測甚至輔助治療提供了新策略［12，13］。繼續(xù)深入miR-124與結腸癌關系的研究，闡明miR-124參與結腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，可為結腸癌的防治提供理論依據(jù)和實驗基礎。

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