張明明（綜述），宋光耀（審校）

（河北省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北石家莊050051）

枯草桿菌溶菌素9在低密度脂蛋白代謝中作用的研究進(jìn)展

張明明（綜述），宋光耀*（審校）

（河北省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北石家莊050051）

桔草桿菌蛋白酶9；脂蛋白類，LDL；綜述文獻(xiàn)

近年來研究顯示枯草桿菌溶菌9（proprotein convertase subtilisin/kexin 9，PCSK9）是導(dǎo)致常染色體顯性高膽固醇血癥的重要基因［1］，它是迄今為止已經(jīng)確定的枯草桿菌前蛋白轉(zhuǎn)化酶超家族的第9個(gè)成員，也被稱作神經(jīng)凋亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化酶1（neural apoptosis-regulated convertase 1，NARC-1），PCSK9分布于肝臟、小腸、小腦、腎臟，在肝臟中表達(dá)量最高，該基因?qū)ε咛r(shí)神經(jīng)元分化及肝臟再生起重要的作用，可通過降解肝臟細(xì)胞上的低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDL-R）來調(diào)控血漿中LDL的水平，增強(qiáng)PCSK9活性的突變可以導(dǎo)致高膽固醇血癥和早發(fā)冠心病；降低PCSK9活性的突變則導(dǎo)致相反的效應(yīng)，即降低LDL水平從而減少冠心病的發(fā)病幾率。雖然PCSK9的作用機(jī)制尚未明確，但PCSK9突變可能為降低血漿LDL水平、防治動(dòng)脈粥樣硬化和早發(fā)冠心病提供新的治療靶點(diǎn)。

1 PCSK9的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

PCSK9編碼的蛋白質(zhì)稱為NARC-1，一種新的前蛋白轉(zhuǎn)換酶，屬于枯草蛋白酶亞家族，該基因位于染色體1P32.3，共有12個(gè)外顯子，編碼含692個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列可分為信號序列、前片段、催化域、P-域和富含半胱氨酸的碳末端幾個(gè)結(jié)構(gòu)域。152位是自身催化裂解的斷裂部，催化區(qū)域包含具有催化能力的三聯(lián)體Asp186-His226-Ser386以及氧化區(qū)域Asn317。PCSK9缺乏蛋白轉(zhuǎn)化酶家族調(diào)節(jié)鈣依賴且調(diào)節(jié)pH值的P結(jié)構(gòu)域（P-domain）［2］，催化域后是一段含有279個(gè)氨基酸的富含半胱氨酸的碳末端。蛋白初合成時(shí)是一段72kDa的前體，為可溶性的酶原狀態(tài)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)過自身催化后在前片段和催化域之間發(fā)生斷裂，PCSK9分子的斷裂位點(diǎn)（Val-Phe-Ala-Gln↓Ser-Ile-Pro），與其他的前蛋白轉(zhuǎn)化酶不一樣。PCSK9的自身催化斷裂不需要鈣離子［3］。成熟的PCSK9和相關(guān)的前片段在分泌前都要經(jīng)過酪氨酸的硫酸酯化，但PCSK9翻譯后修飾的作用尚未明確［4］。

2 PCSK9表達(dá)對LDL-R水平的調(diào)節(jié)

PCSK9基因突變導(dǎo)致高膽固醇血癥這一發(fā)現(xiàn)證實(shí)基因突變后或是通過增加PCSK9的正?；钚裕蚴峭ㄟ^賦予蛋白某種新的功能。有研究顯示在野生型C57BL/6小鼠體內(nèi)導(dǎo)入腺病毒介導(dǎo)的人PCSK9基因使其過表達(dá)，與僅導(dǎo)入腺病毒空載體的小鼠相比，血漿總膽固醇明顯提高，非高密度脂蛋白膽固醇C提高5倍，其表型接近于LDL-R基因敲除小鼠；而將PCSK9基因?qū)肽懝檀妓皆据^高的LDL-R基因缺陷小鼠，與對照組相比，血脂水平并未進(jìn)一步增高，提示PCSK9基因增高血漿LDL水平的過程依賴于LDL-R的存在［5］。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，將人PCSK9基因?qū)肱囵B(yǎng)的細(xì)胞，并未見LDL-R mRNA水平改變，但LDL-R蛋白表達(dá)卻顯著減少，且細(xì)胞對熒光標(biāo)記的LDL內(nèi)吞功能顯著降低。PCSK9基因降低細(xì)胞表面LDL-R蛋白并干擾LDL-R介導(dǎo)的細(xì)胞對膽固醇的攝取，但也有人［6］認(rèn)為PCSK9基因可能不是通過傳統(tǒng)的固醇調(diào)節(jié)元件介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄途徑調(diào)節(jié)LDL-R表達(dá)，而是通過新的機(jī)制調(diào)節(jié)LDL-R功能。在McA RH7777大鼠肝癌細(xì)胞中過表達(dá)野生型PCSK9，使LDL-R蛋白減少72％，與1，1′-雙十八烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽（1，1′-dioctadecyl-3，3，3′，3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，DiI）標(biāo)記的LDL的結(jié)合降低52％，而在人肝癌細(xì)胞株HuH7中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染雙鏈siRNA使LDL-R的表達(dá)、DiI和LDL的結(jié)合分別增加33％和2.2倍［7］。這提示PCSK9可能通過對LDL-R的負(fù)向調(diào)節(jié)而發(fā)揮作用。

與野生型小鼠相比，PCSK9-/-小鼠的血漿膽固醇水平降低48％，肝LDL-R蛋白的水平升高2.8倍，而LDL-R mRNA則沒有明顯變化，這與PCSK9過表達(dá)降低LDL-R蛋白水平而不改變LDL-R mRNA相一致［8］。因此，可以推斷無論是野生型還是突變體，PCSK9的過表達(dá)通過翻譯后機(jī)制來降低LDL-R的水平。

3 細(xì)胞內(nèi)PCSK9的作用位點(diǎn)

在細(xì)胞內(nèi)PCSK9和LDL-R的作用路徑一致，在細(xì)胞表面則有所不同，LDL-R與細(xì)胞膜結(jié)合而PCSK9則迅速分泌到細(xì)胞質(zhì)中去。PCSK9還可以通過肝臟分泌到細(xì)胞外，因此可以在血漿中檢測到［9－10］。PCSK9在細(xì)胞內(nèi)的作用位點(diǎn)尚未明確。在HepG2細(xì)胞中，PCSK9的過表達(dá)并不能影響LDL-R合成或從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向外轉(zhuǎn)運(yùn)，而且蛋白體抑制因子也不干擾PCSK9介導(dǎo)的LDL-R水平的下調(diào)。PCSK9的高表達(dá)增加了成熟的、糖基化形式的LDL-R的降解。但布雷菲德菌素a（一種可以引起高爾基復(fù)合體分解的真菌毒素）可以阻止PCSK9對LDL-R的降解。這些資料顯示在LDL-R從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向細(xì)胞膜表面轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中，PCSK9可促進(jìn)其降解［11］。

另一方面，PCSK9在分泌通道中并無活性，而只在分泌后作用于LDL-R。在分泌過程中，前片段與成熟蛋白緊密結(jié)合，據(jù)推測其作用是抑制PCSK9的催化活性。在其他的前蛋白轉(zhuǎn)化酶中，前片段在高爾基體或分泌后經(jīng)過第2次蛋白酶解加工解除其抑制作用，暴露酶活性。初步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示PCSK9還可以在細(xì)胞外發(fā)揮其作用，把純化的PCSK9或含PCSK9的條件培養(yǎng)基作用于HepG2細(xì)胞，可以減少HepG2細(xì)胞表面LDL-R的數(shù)目。當(dāng)外源性PCSK9作用于細(xì)胞時(shí)，LDL-R與PCSK9迅速發(fā)生免疫沉淀反應(yīng)，這一現(xiàn)象暗示兩種蛋白之間存在某種物理聯(lián)系，在常染色體隱性高膽固醇血癥（autosomal recessive hypercholesterolemia，ARH）患者中，缺乏一種LDL-R細(xì)胞內(nèi)攝作用所必需的內(nèi)吞銜接蛋白，而這種蛋白對PCSK9介導(dǎo)的LDL-R的降解是必要的，ARH患者缺少這種蛋白，LDL-R和PCSK9都不能被細(xì)胞攝入，不能發(fā)揮相互作用，因此LDL-R的數(shù)目沒有改變［12］。以上研究結(jié)果揭示了PCSK9加速LDL-R降解的幾種作用機(jī)制，在細(xì)胞表面，PCSK9以無催化活性的形式與LDL-R結(jié)合，然后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在酸性環(huán)境下發(fā)揮其作用，導(dǎo)致LDL-R降解。另一方面，與LDL-R結(jié)合，PCSK9可能妨礙細(xì)胞內(nèi)攝作用后LDL-R的正常再利用，使LDL-R在溶酶體降解而不是回到細(xì)胞表面。

4 PCSK9功能獲得型突變

與高膽固醇血癥有關(guān)的PCSK9突變稱為功能獲得型突變。PCSK9選擇性錯(cuò)義突變可以導(dǎo)致高膽固醇血癥。血漿中主要攜帶膽固醇的脂蛋白，LDL-C的水平取決于LDL生成與清除的相對比率。

Lambert等［13］在2個(gè)法國家庭中發(fā)現(xiàn)了位于1號染色體短臂三區(qū)二帶與ADH相關(guān)的錯(cuò)義突變，這兩個(gè)錯(cuò)義突變是PCSK9外顯子2的S127R（625T＞A）突變和外顯子4的F216L（890C＞T）突變。

自此開始，陸續(xù)有人報(bào)道PCSK9的錯(cuò)義突變，這些突變均導(dǎo)致高膽固醇血癥，而且報(bào)道中沒有發(fā)現(xiàn)LDL-R和ApoB基因突變。包括L108R突變［1］、D35Y突變［1］、D374Y突變［14－15］，R218S、R357H突變［16］、c.1863＋94A＞G突變［17］、I474V突變［18］、外顯子6的R306S突變［19］、A617D突變［20］以及E670G突變［21］等。另外，在FH患者中還發(fā)現(xiàn)了3種PCSK9錯(cuò)義突變R469W、N425S、R496W。其中，外顯子12的E670G突變［21］可引起血漿LDL-C水平的升高，有3.5％變異率，是LDL-C水平和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重程度的基因標(biāo)志物。

5 PCSK9功能缺失型突變

PCSK9引起低膽固醇血癥的突變又稱為功能缺失型突變。無義突變和錯(cuò)義突變均可引起低膽固醇血癥。Cohen等［22］對DHS中1769例LDL-C水平低于正常人群5個(gè)百分點(diǎn)的非裔美國人PCSK9的編碼區(qū)域進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)每50例非洲裔美國人中就有1例發(fā)生了無義突變Y142X或C679X，使LDL的水平下降40％。在DHS中1784例非非裔的美國人中，1例西班牙人和1例歐洲人的PCSK9基因中均發(fā)現(xiàn)了C679X突變，該突變導(dǎo)致了終止密碼子提前出現(xiàn)。但在攜帶該突變的雜合患者中發(fā)現(xiàn)膽固醇的內(nèi)源性生物合成或腸道吸收似乎都沒有發(fā)生改變。在DHS研究的非裔美國人中，Y142X和C679X突變率為1.8％；而在伊利諾斯州庫克郡的850例非裔美國人中，上述兩個(gè)突變的發(fā)生率為2.2％。在來自優(yōu)魯巴語鄉(xiāng)村社區(qū)的549例尼日利亞人中C679X突變率為1.4％。在津巴布韋653例產(chǎn)婦中發(fā)現(xiàn)3.7％的患者存在C679X突變，而且血漿LDL-C水平明顯低于無突變?nèi)巳海?3－24］。此外，Zhao等［25］還發(fā)現(xiàn)YI42X突變影響mRNA的生物合成過程，故不能生成成熟的PCSK9蛋白。C679X突變不改變自身催化活性，但C-末端的半胱氨酸提前終止干擾蛋白的正確折疊，導(dǎo)致成熟蛋白滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。這些結(jié)果提示YI42X突變影響蛋白的合成，C679X突變干擾蛋白的折疊。

其他與血漿LDL-C水平下降有關(guān)的PCSK9突變陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，包括框內(nèi)突變和錯(cuò)義突變，如L235F突變、A443T突變、R46L突變、Q152H突變、P174S突變、G106R突變、R237W突變［24，26－29］。其中非裔美國人中發(fā)現(xiàn)的L235F突變可使LDL水平下降30％，A443T突變的純合子和雜合子使LDL-C分別下降29.2％和3.5％。R46L突變在歐洲人中的發(fā)生率為3.4％，LDL水平下降了21.3％。而Cameron等［28］認(rèn)為G106R雖不影響Asp186-His226-Ser386的催化能力，但可顯著降低自身催化能力，導(dǎo)致成熟蛋白顯著減少。

6 問題與展望

PCSK9錯(cuò)義突變引起人類常染色體高膽固醇血癥的原因即“功能獲取機(jī)制”。這些致病突變基因的發(fā)現(xiàn)有助于深入探討膽固醇代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制，能進(jìn)一步將LDL-C從血管中清除，阻止造成冠心病的血管斑塊形成。盡管關(guān)于PCSK9基因在LDL代謝中的生物重要性的研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但還有許多重要的機(jī)制和臨床問題有待解決。首先，PCSK9表達(dá)和功能獲得型突變促進(jìn)LDL-R降解的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步闡明；第二，盡管已經(jīng)提出了PCSK9的結(jié)構(gòu)模型，但晶體模型尚無報(bào)道。對PCSK9的3D結(jié)構(gòu)的闡述為PCSK9的作用機(jī)制的研究提供了一個(gè)新的角度。還需要進(jìn)一步證實(shí)PCSK9在細(xì)胞中的作用位點(diǎn)，以及LDL-R的降解是否與其催化活性相關(guān)。盡管PCSK9的遺傳缺陷與獨(dú)立于LDL代謝的明顯表型不相關(guān)，PCSK9仍可能通過其他途徑發(fā)揮作用。因此，對PCSK9研究尚不完善，需繼續(xù)深入研究。

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（本文編輯：劉斯靜）

R543.1

A

1007-3205（2013）04-0490-05

2012－08－14；

2012－09－04

張明明（1976－），女，河北秦皇島人，河北省人民醫(yī)院主管檢驗(yàn)師，醫(yī)學(xué)博士，從事內(nèi)分泌代謝疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：Sguangyao＠sohu.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.04.047