王 玲，尚云青，匡 鈺，張美欣

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江 524088；2.云南中醫(yī)學(xué)院，云南昆明650500；3.云南省德宏熱帶作物科學(xué)研究所，云南德宏 678600）

菠蘿（Ananas comosus）學(xué)名鳳梨，是著名的熱帶、亞熱帶特產(chǎn)水果之一，成熟時(shí)不僅色澤鮮艷，而且氣味芳香、味道清甜、深受廣大消費(fèi)者的喜愛。分析測(cè)試結(jié)果表明：菠蘿鮮果中含水量達(dá)80%以上，還含有大量的還原糖，維生素A、B、C，磷和檸檬酸等，且糖酸比例合適[1]，非常適合于釀酒。由菠蘿汁釀成的菠蘿酒營(yíng)養(yǎng)分豐富，是一種兼具營(yíng)養(yǎng)與保健價(jià)值的低度果酒[2]。但目前菠蘿果酒的生產(chǎn)由于沒有專用的酵母菌，而大多采用市售的葡萄酒用活性干酵母進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)品缺乏菠蘿果實(shí)特有的香氣，風(fēng)味欠佳。針對(duì)這些問題，本課題組之前對(duì)菠蘿果酒發(fā)酵專用菌種進(jìn)行了篩選[3]，并在近期制作成了活性干酵母，本研究對(duì)自制的活性干酵母發(fā)酵菠蘿果酒的適宜條件進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菠蘿 八成熟，無刺卡因種，湛江鷹峰食品有限責(zé)任公司生產(chǎn)基地；菠蘿果酒活性干酵母 以自行篩選的優(yōu)良酵母菌為出發(fā)菌株，在一定的條件下對(duì)酵母菌進(jìn)行培養(yǎng)，真空冷凍干燥制得的活性干酵母；檸檬酸、無水亞硫酸鈉 均為分析純；HR1861榨汁機(jī) 珠海飛利浦家用電器有限公司；SPX-250B恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；HZQ-F-160振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分析檢測(cè)方法 總酸（以檸檬酸計(jì)，g/100mL）酸堿滴定法[4]；酒度（v/v，20℃） 蒸餾法[5]；總糖（g/100mL）GB/T 15037-2006葡萄酒及果酒中總糖的測(cè)定[6]；二氧化硫（mg/L）GB/T 5009.34-2003食品中亞硫酸鹽的測(cè)定[7]；菌落總數(shù)測(cè)定（cfu/mL）GB/T 4789.2-2010食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定[8]；大腸菌群測(cè)定 大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法，按GB/T 4789.2-2010執(zhí)行[9]。

1.2.2 菠蘿果酒生產(chǎn)工藝

1.2.3 操作要點(diǎn) 選取八成熟的無病蟲害且無霉?fàn)€變質(zhì)的新鮮菠蘿果實(shí)，經(jīng)預(yù)處理后榨汁，調(diào)節(jié)菠蘿汁的糖酸，向菠蘿汁中加入一定量的SO2抑制雜菌生長(zhǎng)，取一定量的自制菠蘿酒用活性干酵母復(fù)水活化后，進(jìn)行酒精發(fā)酵。

1.3 菠蘿果酒發(fā)酵工藝條件的單因素實(shí)驗(yàn)

菠蘿汁的發(fā)酵溫度、pH、初始糖度及接種量四因素是影響菠蘿果酒發(fā)酵質(zhì)量的主要因素。分別設(shè)計(jì)在26、28、30、32、34℃的發(fā)酵溫度；pH為4、4.5、5、5.5、6；初始糖度為15、17、19、21、23°Brix；接種量分別為2%、3%、4%、5%、6%的條件下發(fā)酵6d，以生成的酒精度為考核指標(biāo)，對(duì)菠蘿果酒發(fā)酵工藝條件進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.4 菠蘿果酒發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

在初始糖度、發(fā)酵溫度、pH、接種量單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用二次回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)[10]來進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，二次回歸設(shè)計(jì)參數(shù)為p=4，mc=16，γ=2.000，m0=12，n=36，實(shí)驗(yàn)的因素水平編碼表見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 菠蘿果酒發(fā)酵工藝條件的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵溫度對(duì)菠蘿果酒發(fā)酵的影響 發(fā)酵溫度對(duì)果酒的發(fā)酵有很大影響，如果溫度過高，雖然可提高發(fā)酵速度，但容易使微生物細(xì)胞活性快速降低，發(fā)酵能力減弱；溫度太低，在發(fā)酵初期容易感染雜菌造成發(fā)酵失敗。由圖1可知，在26～34℃的選定的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)溫度范圍內(nèi)，32℃條件下的發(fā)酵溫度比較理想。

2.1.2 pH對(duì)菠蘿果酒發(fā)酵的影響 pH對(duì)菠蘿果酒發(fā)酵的影響如圖2所示。隨著pH的增加，酵母菌酒精產(chǎn)率先增強(qiáng)后減弱，pH為5.5時(shí)達(dá)到最大。所以，菠蘿果酒發(fā)酵液的理想pH為5.5。

2.1.3 初始糖度對(duì)菠蘿果酒發(fā)酵的影響 初始糖度對(duì)菠蘿果酒發(fā)酵的影響如圖3所示。從圖3中可以看出，初始糖度在21°Brix之前，酒精度隨著初始糖度的增加而增高，但之后糖度增加，酒精生成量反而下降，這主要是因?yàn)樘呛刻撸湍讣?xì)胞的滲透壓增大，對(duì)酵母菌細(xì)胞內(nèi)酶的活性產(chǎn)生一定的影響，所以，21°Brix生成的酒精度比較理想。

2.1.4 接種量對(duì)菠蘿果酒發(fā)酵的影響 接種量直接影響菠蘿果酒發(fā)酵的酒精度，接種量太低，不但發(fā)酵速度變得緩慢，而且容易使發(fā)酵液在發(fā)酵初期感染雜菌，影響發(fā)酵進(jìn)程；接種量太高，雖然發(fā)酵初期可提高發(fā)酵速度，但會(huì)造成酒液發(fā)酵后勁不足。由圖4可以看出，接種量為5%時(shí)，酒精生成量較高。

2.2 菠蘿果酒發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

根據(jù)菠蘿果酒發(fā)酵的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按照表1的方法對(duì)菠蘿果酒發(fā)酵進(jìn)行四因素二次回歸正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以確定最優(yōu)工藝條件，結(jié)果如表2所示。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以發(fā)酵酒精度為響應(yīng)值，運(yùn)用SAS RSREG（response surface regression）程序[11]對(duì)36個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表3、表4。

由表3、表4分析結(jié)果可以看出，因素X1（溫度），X2（pH）、X3（初始糖度）和X4（接種量）對(duì)酒精度呈極顯著（p＜0.01）影響，因素X1X2、X1X4、X2X3、X3X4對(duì)響應(yīng)值的曲面效應(yīng)也呈現(xiàn)極顯著影響，由此可以得出結(jié)論為：溫度、pH、初始糖度和接種量是菠蘿果酒發(fā)酵工藝中重要的影響因素，根據(jù)F值的大小，確定四個(gè)因素對(duì)發(fā)酵酒度的影響大小為：X3＞X2＞X1＞X4，即：初始糖度＞pH＞溫度＞接種量。

經(jīng)SAS回歸擬合后，各實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值酒精度的影響可以通過回歸方程表示為：

Y=8.1+0.2972X1+0.2958X2+0.2625X3+0.1792X4-0.2823+0.2813X1X2+0.1188X2X3+0.1938X1X4+0.2063X3X4-0.28232-0.3037-0.1948-0.4948，模型可信度分析見表5。

綜合表3～表5可知，用回歸方程描述各實(shí)驗(yàn)因子與響應(yīng)值酒精度之間的關(guān)系時(shí)，其因變量酒精度與全體自變量包括溫度、pH、初始糖度、接種量之間的多元回歸關(guān)系顯著，復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方（R2）為0.9573，表明該模型理論上可以反映響應(yīng)值的95.73%。響應(yīng)值的變異系數(shù)（C.V.%）為3.1086，方程模型F值為33.67，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于F0.01（14，15）=3.8的數(shù)值，總的回歸關(guān)系達(dá)到極顯著水平，表明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理，回歸方程在選取的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)上與實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合得較好。同時(shí)，方程失擬項(xiàng)的F值為1.99，p值為0.138（p＞0.05），失擬檢驗(yàn)不顯著，表明回歸方程在整個(gè)回歸區(qū)域的擬合情況良好，即采用該模型是合理的，可以用該方程對(duì)不同發(fā)酵條件下的發(fā)酵酒度進(jìn)行預(yù)測(cè)。

模型優(yōu)化參數(shù)分析可得酒精度最大值所需要的參數(shù)條件為：溫度為33.68℃，pH5.609，初始糖度20.60%，接種量5.48%。在此最優(yōu)工藝下酒精度預(yù)測(cè)值為8.74%。

為進(jìn)一步檢驗(yàn)該預(yù)測(cè)模型的可靠性，采用該模型最優(yōu)化分析所得出的方案通過修整進(jìn)行菠蘿果酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)[12]，實(shí)際操作條件調(diào)整為：溫度33.7℃，pH5.6，初始糖度20.5%，接種量5.5%，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)取平均值，實(shí)際測(cè)得的酒精度為8.7%±0.2%。在顯著性水平p＜0.05的前提下，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值無顯著性差異。由此可得，采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化得到的酒精發(fā)酵條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，模型具有實(shí)用價(jià)值。

2.3 響應(yīng)面分析

影響菠蘿果酒發(fā)酵的各實(shí)驗(yàn)因素（溫度、pH、初始糖度和接種量）之間的交互作用與響應(yīng)值（酒精度）之間的關(guān)系，如圖5～圖8所示。

2.3.1 溫度與pH的交互作用對(duì)發(fā)酵酒度的影響 由圖5可得，溫度與pH的交互作用對(duì)發(fā)酵酒度的影響顯著，曲面呈現(xiàn)良好的拱形，存在最大值。隨著發(fā)酵溫度和pH的增加，發(fā)酵酒度隨之增加，達(dá)到最高點(diǎn)后，又逐漸減小。當(dāng)pH很低時(shí)，溫度對(duì)酒精度的影響較小，這是因?yàn)檫^高的酸度抑制了酵母菌的活性，影響其生長(zhǎng)。

2.3.2 溫度與接種量的交互作用對(duì)發(fā)酵酒度的影響由圖6可以看出，溫度與接種量的交互作用對(duì)發(fā)酵酒度的影響顯著。當(dāng)接種量一定時(shí)，隨著溫度升高，酵母細(xì)胞活性逐漸增強(qiáng)，酒精生成量不斷上升，但當(dāng)溫度升到一定水平時(shí)，酵母菌菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)和酶的抗熱性降低，酒精度就會(huì)逐漸下降，所以出現(xiàn)酒精度先升高后降低的現(xiàn)象，并且變化趨勢(shì)比較明顯。

2.3.3 pH與初始糖度的交互作用對(duì)發(fā)酵酒度的影響圖7可以看出，pH與初始糖度的交互作用對(duì)發(fā)酵酒度的影響顯著，曲面呈現(xiàn)良好的拱形，存在最大值。隨著pH與初始糖的增加，發(fā)酵酒度隨之增加，達(dá)到最高點(diǎn)后，又逐漸減小。

2.3.4 初始糖度與接種量對(duì)發(fā)酵酒度的影響 由圖8可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，初始糖度與接種量對(duì)發(fā)酵酒度的影響顯著，在接種量一定時(shí)，隨著初始糖度的增加，發(fā)酵酒度也隨之增加，達(dá)到最高點(diǎn)后，又逐漸減小。這是因?yàn)檫^高的初始糖度在發(fā)酵后期會(huì)造成較高的滲透壓而抑制酵母菌的活性，影響其生長(zhǎng)。

2.4 菠蘿果酒品質(zhì)檢驗(yàn)

將自制菠蘿果酒活性干酵母按以上研究的最佳工藝條件對(duì)菠蘿果汁進(jìn)行發(fā)酵，得到的菠蘿果酒與市售葡萄酒用活性干酵母發(fā)酵所得的菠蘿果酒進(jìn)行比較，各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)如表6所示。

由表6可以看出，自制菠蘿果酒活性干酵母與市售的葡萄酒用活性干酵母發(fā)酵的菠蘿果酒酒度在色澤、組織狀態(tài)等方面沒有明顯的區(qū)別，都呈清亮透明的金黃色，但自制活性干酵母發(fā)酵所得的菠蘿果酒比市售的葡萄酒用活性干酵母發(fā)酵所得的菠蘿果酒在風(fēng)味方面有一定優(yōu)勢(shì)，菠蘿果香濃郁，風(fēng)味較好，酒精度也較高，達(dá)到8.7%，比市售葡萄酒用活性干酵母發(fā)酵所得的菠蘿果酒高0.9%。

3 結(jié)論

將自制菠蘿果酒活性干酵母進(jìn)行復(fù)水活化后應(yīng)用到菠蘿果汁的發(fā)酵中，用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化其工藝條件。菠蘿果酒發(fā)酵過程的模型為：Y=8.1+0.2972X1+0.2958X2+0.2625X3+0.1792X4-0.2823X12+0.2813X1X2+0.1188X2X3+0.1938X1X4+0.2063X3X4-0.2823X12-0.3037X22-0.1948X42-0.4948X32；優(yōu)化得到的最佳發(fā)酵工藝條件為：溫度33.7℃、pH5.6、初始糖度20.5%、接種量5.5%，在此條件下發(fā)酵的菠蘿果酒的酒度比葡萄酒用活性干酵母發(fā)酵所得的菠蘿果酒高，達(dá)到8.7%，而且菠蘿果香濃郁，風(fēng)味較好。

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[4]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 12456-1990食品中總酸的測(cè)定方法[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，1990.

[5]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB-T 15038-2006葡萄酒、果酒通用實(shí)驗(yàn)方法[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006.

[6]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 5009.7-2003食品中總糖的測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

[7]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 5009.34-2003食品中亞硫酸鹽的測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

[8]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 4789.2-2010食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[9]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 4789.2-2010食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

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