周海旭，李忠海，鐘海雁，張 慧，李文清

（中南林業(yè)科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

近年來(lái)，有關(guān)研究結(jié)果表明，多酚類物質(zhì)具有抗氧化、抗脂質(zhì)氧化、抗菌、抗病毒、預(yù)防心血管疾病、防癌、抗輻射等生物活性[1-5]，還具有滅菌或防治病蟲(chóng)害的功效，因此可用以生產(chǎn)抑菌劑或防腐劑而被用于食品加工和運(yùn)輸?shù)刃袠I(yè)中[6]。樟樹(shù)作為常見(jiàn)的經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種，其葉子中含有豐富的多酚類物質(zhì)，通常將樟樹(shù)葉中的多酚類物質(zhì)稱為樟樹(shù)多酚[7]。

超聲波可以破壞細(xì)胞的細(xì)胞壁，改善目標(biāo)產(chǎn)物的選擇性，增加提取率，在天然產(chǎn)物提取中顯示出了明顯的優(yōu)勢(shì)[8]，超聲波提取法具有能縮短提取時(shí)間、提高有效成分得率且保護(hù)熱敏性成分等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在越來(lái)越多地被應(yīng)用于植物有效成分的提取[9]。為了研究以超聲波法提取樟樹(shù)多酚的最優(yōu)工藝條件，筆者用Folin-ciocalteus法測(cè)定樟樹(shù)多酚，該法靈敏度較高，簡(jiǎn)便易行[10]，并以乙醇為提取劑，采用響應(yīng)面分析[11]方法，就提取時(shí)間、料液比和乙醇濃度對(duì)樟樹(shù)多酚提取量的影響問(wèn)題進(jìn)行了試驗(yàn)，建立了超聲波提取樟樹(shù)多酚的數(shù)學(xué)模型，從而獲得了樟樹(shù)多酚超聲波提取的最優(yōu)工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)用的樟樹(shù)葉于2011年5月采自中南林業(yè)科技大學(xué)，將新鮮樹(shù)葉曬干后粉碎以備用。

1.2 主要儀器

電子天平，上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；HWS26型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；JY92-11超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；紫外分光光度儀，島津公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取焦性沒(méi)食子酸1 g，溶解并定容于100 mL的容量瓶中以備用。分別量取4、8、12、16、20 mL的標(biāo)準(zhǔn)液加入到100 mL的容量瓶中，再分別加入60 mL的蒸餾水，充分混合3 min；再分別加入酚試劑5 mL和20 %無(wú)水碳酸鈉15 mL，充分混合1 min后定容。于70 ℃水浴，保持時(shí)間為10 min，冷卻至室溫后，在波長(zhǎng)為760 nm的條件下測(cè)定吸光度[12]。根據(jù)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液及吸光度繪制如圖1的標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：上式中：x為標(biāo)準(zhǔn)液的濃度（mg/L），y為吸光度。

圖1 測(cè)定多酚含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of polyphenols content

1.3.2 單因素試驗(yàn)

通過(guò)單因素試驗(yàn)分別考察超聲提取時(shí)間、料液比、乙醇濃度這3個(gè)因素對(duì)樟樹(shù)多酚濃度的影響情況，確定各個(gè)試驗(yàn)因素的最優(yōu)水平，從而為響應(yīng)面分析試驗(yàn)提供參考依據(jù)。

1.3.3 響應(yīng)面分析

采用Design-Expert 8.0.7軟件中的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定乙醇濃度、提取溫度和液料比3個(gè)因素，以樟樹(shù)葉多酚含量為響應(yīng)值。試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 樟樹(shù)葉多酚提取的響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment of polyphenols extraction in Cinnamanum camphoral

1.4 數(shù)據(jù)計(jì)算公式

樟樹(shù)多酚的提取量 (mg)＝提取液的體積×樟樹(shù)葉多酚濃度×100×10-3×2；

上列兩式中：提取液的體積單位為mL，多酚的濃度單位為mg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 超聲提取時(shí)間對(duì)提取的樟樹(shù)多酚濃度的影響

超聲提取時(shí)間對(duì)提取的樟樹(shù)多酚濃度的影響情況如圖2所示。從圖2中可以看出，當(dāng)超聲波提取時(shí)間為25 min左右時(shí)，提取液中的多酚濃度最大；而當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)，提取液中的多酚濃度卻隨之下降。這可能因?yàn)殡S著時(shí)間的延長(zhǎng)多酚物質(zhì)被氧化，或者發(fā)生其他的化學(xué)反應(yīng)而使得多酚濃度下降。

圖2 提取時(shí)間對(duì)樟樹(shù)多酚提取濃度的影響Fig.2 Effect of extraction time on concentration of extracted polyphenols in Cinnamanum camphoral

2.1.2 料液比對(duì)提取的樟樹(shù)多酚濃度的影響

料液比對(duì)提取的樟樹(shù)多酚濃度的影響情況如圖3所示。從圖3中可以看出，提取的樟樹(shù)多酚濃度隨著料液比的增加而增加，當(dāng)料液比為1∶30左右時(shí)，提取液中的多酚濃度最大，之后隨著料液比的增加提取濃度卻稍微減小。考慮到成本與所提取的樟樹(shù)多酚濃度，故選用1∶30的料液比。

圖3 料液比對(duì)樟樹(shù)多酚提取濃度的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on concentration of extracted polyphenols in Cinnamanum camphoral

2.1.3 乙醇濃度對(duì)提取的樟樹(shù)多酚濃度的影響

乙醇濃度對(duì)提取的樟樹(shù)多酚濃度的影響情況如圖4所示。從圖4中可以看出，隨著乙醇濃度的增加，樟樹(shù)多酚的提取濃度也隨之增加。當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，多酚濃度達(dá)到最大值；但之后隨著乙醇濃度的增加，樟樹(shù)多酚的提取濃度反而趨于平緩。其原因可能是，隨著乙醇濃度的增加，多酚類物質(zhì)在乙醇溶液中的溶解度增加，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%以后，溶液極性增加，導(dǎo)致多酚類物質(zhì)的溶解度下降[13]，所以選擇濃度為60%的乙醇作為提取溶劑。

圖4 乙醇濃度對(duì)樟樹(shù)多酚提取濃度的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on concentration of extracted polyphenols in Cinnamanum camphoral

2.2 樟樹(shù)葉多酚提取響應(yīng)面法優(yōu)化分析

2.2.1 超聲波提取樟樹(shù)多酚的模型建立

響應(yīng)面試驗(yàn)共設(shè)有17組試驗(yàn)，其中有12個(gè)分析點(diǎn)、5個(gè)中心點(diǎn)試驗(yàn)。采用響應(yīng)面分析法分析試驗(yàn)結(jié)果，得到了如下的以多酚含量為響應(yīng)值的數(shù)學(xué)模型：

式中：Y表示樟樹(shù)多酚提取量的預(yù)測(cè)值，A、B、C分別表示提取時(shí)間、乙醇濃度、料液比的數(shù)值。

采回歸方程中各變率對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性，由F檢驗(yàn)來(lái)判定，“Prob＞F”值小于0.05級(jí)表示該指標(biāo)顯著。模型回歸方程方差分析結(jié)果如表2所示。由表2可知，模型P值＜0.01，表明該二次方程的模型極為顯著[14]，可利用該模型來(lái)預(yù)測(cè)分析以超聲波提取的樟樹(shù)多酚的含量。提取時(shí)間（A）對(duì)樟樹(shù)多酚含量的影響是極顯著的，乙醇濃度（B）、料液比（C）對(duì)樟樹(shù)多酚含量的影響也具有顯著性，A和B的交叉因素、A和C的交叉因素對(duì)樟樹(shù)多酚含量的影響也具有顯著性。借助數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行優(yōu)化，最終得出的樟樹(shù)多酚超聲波提取的最優(yōu)工藝條件為：超聲提取時(shí)間25 min、乙醇濃度60%、料液比1∶40。在此工藝條件下獲得的多酚含量為40.794 mg/g。

表2 樟樹(shù)多酚含量的ANOVA分析結(jié)果Table 2 ANOVA analysis of content of extracted polyphenols in Cinnamanum camphoral

2.2.2 超聲波提取樟樹(shù)多酚各影響因素的交互作用

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)試驗(yàn)因子A、B、C所構(gòu)成的三維空間曲面圖，從響應(yīng)面分析圖中可以看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用情況。根據(jù)回歸方程作出不同試驗(yàn)因素的響應(yīng)面分析圖（見(jiàn)圖5～7）[15]，圖5～7可以直觀地反映出兩個(gè)變量交互作用影響的顯著程度。因?yàn)闃O值條件出現(xiàn)在等高線的圓心處，從圖5～7中可以看出，B與C的等高線圖最圓，說(shuō)明乙醇濃度和料液比之間的交互作用對(duì)樟樹(shù)多酚含量的影響最小；而等高線圖越扁平，則表示試驗(yàn)因素之間交互作用的影響越大[16]。

提取時(shí)間（A）與乙醇濃度（B）對(duì)樟樹(shù)多酚交互作用的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖5。由圖5可知，隨著提取時(shí)間的增加樟樹(shù)多酚的含量呈逐漸增加的變化趨勢(shì)，所以提取時(shí)間可選擇25 min。當(dāng)提取時(shí)間固定為25 min時(shí)，樟樹(shù)多酚的含量隨著乙醇濃度的增加呈現(xiàn)出先增加后減少的變化趨勢(shì)；當(dāng)乙醇濃度為60%左右時(shí)，樟樹(shù)多酚的含量達(dá)到本試驗(yàn)的最大值。這一試驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇濃度與提取時(shí)間二者的交互作用對(duì)樟樹(shù)多酚的含量的影響較大。

提取時(shí)間和料液比對(duì)樟樹(shù)多酚交互作用的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖6。由圖6可知，隨著提取時(shí)間和料液比的增加樟樹(shù)多酚含量也逐步增加。因此，料液比應(yīng)選擇1∶40，超聲提取時(shí)間和料液比二者的交互作用對(duì)樟樹(shù)多酚含量的影響較大。

圖5 提取時(shí)間（A）與乙醇濃度（B）對(duì)樟樹(shù)多酚含量交互作用的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plot of interaction of extraction time (A) and ethanol concentration (B) on content of extracted polyphenols in Cinnamanum camphoral

圖6 提取時(shí)間和料液比對(duì)樟樹(shù)多酚含量交互作用的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot of interaction of extraction time and solid-liquid ratio on content of extracted polyphenols in Cinnamanum camphoral

乙醇濃度和料液比對(duì)樟樹(shù)多酚交互作用的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖7，由圖7可知，樟樹(shù)多酚的提取量隨著乙醇濃度和料液比的增加呈現(xiàn)出先增加后減小的變化趨勢(shì)，乙醇濃度和料液比二者的交互作用對(duì)樟樹(shù)多酚含量的影響較小。

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法[17]分析了乙醇濃度、提取時(shí)間和料液比對(duì)樟樹(shù)多酚超聲波提取效率的影響情況，最終確定的樟樹(shù)多酚超聲波提取的最優(yōu)工藝條件為：提取時(shí)間25 min，料液比1:40，乙醇濃度60%。在此工藝條件下，樟樹(shù)多酚的含量為40.794 mg/g。

圖7 乙醇濃度與料液比對(duì)樟樹(shù)多酚含量的交互作用響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plot of interaction of ethanol concentration and solid-liquid ratio on content of extracted polyphenols in Cinnamanum camphoral

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