于 瑤，劉小珍，劉惠民，張漢堯

（西南林業(yè)大學(xué) 西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224）

獼猴桃是原產(chǎn)于我國(guó)的野生多年生藤本落葉植物，屬于獼猴桃科Actinidiaceae獼猴桃屬Actinidia，是當(dāng)前世界新興的果樹(shù)之一。獼猴桃屬共有66個(gè)種，約有118個(gè)種下分類單位（變種、變型）[1]。獼猴桃與中美洲鱷梨、美國(guó)東部越桔及澳洲堅(jiān)果同為20世紀(jì)人工馴化栽培成就最大的四大野生果樹(shù)樹(shù)種，因其具有很高的實(shí)用價(jià)值，而且耐貯藏，近幾年在世界各地得到了迅速的發(fā)展[2-6]。

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（polygalacturonase inhibiting protein, PGIP）廣泛存在于雙子葉植物細(xì)胞壁中，富含亮氨酸區(qū)域，能夠非競(jìng)爭(zhēng)性地抑制多種真菌的多聚半乳糖醛酸酶的活性，干擾灰霉菌等種真菌病害對(duì)植物組織的侵染過(guò)程，從而抑制這些真菌病害的發(fā)生。它能與多聚半乳糖醛酸酶（PG polygalacturonase）結(jié)合，從而降低和抑制該酶的活性并且誘導(dǎo)寡聚糖的形成，因而在植物的防御反應(yīng)中起著重要的作用[7-12]。而克隆和分析某一功能基因可從分子水平上了解其結(jié)構(gòu)，并可為直接利用該功能基因打下基礎(chǔ)，在經(jīng)濟(jì)林中目前已有許多基因被克隆和分析[13-16]。自1993年首次從未成熟的樹(shù)莓果實(shí)中分離和純化到PGIP蛋白至今已有越來(lái)越多的植物PGIP基因被人們所克隆和分析[17]。到目前為止，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家先后從蘋果、梨、杏、櫻桃、大豆、番茄、馬鈴薯等25 屬45 種植物中克隆到了PGIP基因或片段，并對(duì)其進(jìn)行了分析[8,18-23]。為了利用云南野生獼猴桃抗病能力強(qiáng)的優(yōu)良特性，為后續(xù)的基因功能確證及獼猴桃品種改良奠定重要的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)利用同源序列克隆法，從云南野生中華獼猴桃Actinidia chinensis中成功克隆了PGIP基因的完整編碼序列，并對(duì)克隆出的基因片段進(jìn)行了如氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域和功能域分析、親疏水性分析、跨膜結(jié)構(gòu)分析及蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等方面的生物信息學(xué)分析，探討了它與其它品種或物種同源基因的相似性，并構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，以期為獼猴桃種質(zhì)改良和抗病研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所收集的云南野生中華獼猴桃葉片和果實(shí)。取樣后用液氮速凍并存于－70 ℃的冰箱中以備用。

1.2 生化試劑

UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒，購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；DNA片段快速純化／回收試劑盒，購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑，購(gòu)于北京百泰克生物技術(shù)有限公司；2×Power Taq PCR MasterMix，購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.3 cDNA的制備

參照有關(guān)文獻(xiàn)[24]中的方法，利用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒，分別取1.5 g果肉、果皮和大約0.1 g葉片提取云南野生中華獼猴桃不同組織的高質(zhì)量RNA，取5 μg總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Rever-tAidTMFirst Strand cDNA Synthesis kit，MBI，USA）的說(shuō)明合成第 1鏈cDNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用于后續(xù)基因片段的擴(kuò)增和驗(yàn)證。

1.4 RT-PCR

根據(jù)GenBank中登錄的PGIP基因序列，采用Primer Primer 5軟件，確定了特異擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游、下游引物分別為：上游引物1為5’-GAGTACTACTGCCATTTCCC-3’，下游引物1為5’-GCGAGACATCAATCACTGTG-3’；上游引物 2 為5’-ATGAAGGCCAGTTTTTTTGGGAGAC-3’，下游引 物 2 為 5’-GCGAGGTAACGGCCTGAGGTTCATT-3’。按照2×Power Taq PCR MasterMix 說(shuō)明書的要求確定的PCR反應(yīng)體系如下：2×MasterMix 25 μL，上游 Primer（10 μM）2 μL，下游 Primer（10 μM）2 μL，模板 2 μL，ddH2O 加至 50 μL。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；退火1 min；72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸7 min。用第1次PCR產(chǎn)物作為模板進(jìn)行2次PCR，繼續(xù)擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳（含0.5 μg·mL-1的溴化乙錠），電壓為3～5 V/cm，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，并照像記錄。

1.5 測(cè)序結(jié)果的生物信息學(xué)分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序得到的核酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列在NCBI上分別用BLASTn和BLASTp進(jìn)行序列相似性分析和功能域分析；然后進(jìn)行氨基酸組分分析、親疏水性分析、信號(hào)肽分析、跨膜區(qū)分析和結(jié)構(gòu)域分析。用Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的各物種的PGIP基因序列進(jìn)行多序列比對(duì)，并通過(guò)鄰接算法（N-J法）完成系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。用TreeView軟件觀看輸出的無(wú)根進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 核酸序列組分分析

利用試驗(yàn)中提取的云南野生獼猴桃總RNA作為模板合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行多次PCR特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得特異條帶，其大小與預(yù)期的一致。送檢測(cè)序后，運(yùn)用BioEdit軟件進(jìn)行拼接并分析，結(jié)果表明：該片段編碼區(qū)長(zhǎng)度為996 bp；分子量為304.4 kDa（單鏈狀態(tài)）和605.3 kDa（雙鏈狀態(tài)）；GC含量48.19%；AT含量51.81%。

2.2 理化性質(zhì)與蛋白信息學(xué)分析

利用ProtParam tool軟件進(jìn)行分析，結(jié)果表明：該蛋白的分子量為37 kDa；理論等電點(diǎn)pI為8.95；總共包括5 194個(gè)原子；其分子式為C1659H2608N434O481S12；在組成該蛋白的20種氨基酸中，亮氨酸（L）所占比例最高，達(dá)到15.1%，而谷氨酸（E）多占比例最低，為0.3%，該蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為28.44，脂肪指數(shù)為98.64；該蛋白為穩(wěn)定蛋白。經(jīng)SignalP 4.0軟件預(yù)測(cè)，該P(yáng)GIP蛋白的N端具信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，表明該蛋白為分泌蛋白，含有由25個(gè)氨基酸組成的N端信號(hào)肽，斷裂位點(diǎn)位于第26個(gè)氨基酸與第28個(gè)氨基酸之間（如圖1所示）。

圖1 PGIP氨基酸序列信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.1 Prediction of the signal peptide of amino acids sequences in PGIP

利用TargetP 1.1 Server-prediction軟件進(jìn)行分析，結(jié)果表明：SP分值最高為0.556，預(yù)測(cè)結(jié)果為定位信號(hào)肽；基于上面分析預(yù)測(cè)的“Loc”可能定位為S 分泌通路即分泌到細(xì)胞周質(zhì)；RC可靠級(jí)別為3級(jí)（0.600＞diff＞0.400）；TPlen預(yù)測(cè)剪切位點(diǎn)序列長(zhǎng)度為25個(gè)氨基酸。利用TMHMM軟件進(jìn)行分析，結(jié)果表明：該蛋白的332個(gè)氨基酸均位于膜表面，該蛋白沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)；蛋白質(zhì)分子的基本特性之一是，親水的極性部分在分子的表面，而疏水的非極性部分在分子內(nèi)部。運(yùn)用ProtScale和BioEdit軟件進(jìn)行分析，結(jié)果表明：該蛋白大約在15～20位氨基酸之間有一個(gè)典型的疏水性區(qū)域，在25～30位氨基酸之間還有個(gè)明顯的疏水性區(qū)域。運(yùn)用NCBI在線分析軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.blast/）進(jìn)行分析，結(jié)果表明：該P(yáng)GIP基因片段含有一個(gè)cl08472超家族結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)N末端富含亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域，往往是兩側(cè)的半胱氨酸豐富域。這是典型的植物抗病基因特征結(jié)構(gòu)。

2.3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用PSIPRED軟件進(jìn)行分析，結(jié)果表明：PGIP基因部分肽段存在一個(gè)α-螺旋和卷曲螺旋區(qū)域及若干個(gè)β-折疊片區(qū)。α-螺旋和卷曲螺旋是PGIP基因肽段的主要組成部分。通過(guò)SWISSMODEL同源建模預(yù)測(cè)分析，預(yù)測(cè)到了其三維結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖2），該區(qū)域含有一個(gè)明顯的Rossman折疊，其中α-螺旋處于β-折疊片的上側(cè)。該蛋白由31.02%的α-螺旋、48.49%的隨機(jī)卷曲、3.61%的β-轉(zhuǎn)角和16.87%的β-折疊組成。

圖2 PGIP蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.2 Prediction of secondary structure of PGIP protein

2.4 序列對(duì)比分析

利用BLAST引擎從NBCI搜索并下載同源的PGIP基因核酸序列，經(jīng)過(guò)比對(duì)分析，結(jié)果表明：該基因與美味獼猴桃PGIP基因的同源性高達(dá)98%；其與越桔灌藍(lán)莓Vaccinium corymbosum（FJ347133）PGIP基因的同源性為78%；與小山本 葡 萄Vitis thunbergii（EU037367、JF832387、JF832388）PGIP基因的同源性為73%；與葡萄Vitis vinifera（AF499451）PGIP基因的同源性為73%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果（見(jiàn)圖3）表明：云南野生種獼猴桃和美味獼猴桃的親緣關(guān)系最近，與越桔灌藍(lán)莓的PGIP基因的同源性較近。

圖3 PGIP基因序列進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of PGIP sequences from different species

3 討 論

PGIP蛋白大多由信號(hào)肽、氨基端、亮氨酸富集區(qū)和羧基端四部分組成，其中亮氨酸富集區(qū)由多個(gè)重復(fù)的LRR組成。LRR結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是R基因的功能區(qū)域，是植物抗病基因（R gene）的特征結(jié)構(gòu)，筆者在研究中也發(fā)現(xiàn)了同樣的特征結(jié)構(gòu)。生化分析結(jié)果表明：該段序列在二級(jí)結(jié)構(gòu)上能形成發(fā)夾狀的β-α單位結(jié)構(gòu)，有利于蛋白質(zhì)間的結(jié)合。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，該保守性特別強(qiáng)的區(qū)域是PGIP蛋白和endo-PG蛋白間相互作用的結(jié)構(gòu)域，所以該段序列也常作為PGIP基因克隆時(shí)引物設(shè)計(jì)的靶序列[25]。所有PGIP蛋白的N端都含有一個(gè)疏水性的信號(hào)肽段，這使其將靶向內(nèi)膜系統(tǒng)輸出到胞外空間，而且信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)也是保守的，均在Ser后剪切[26]，我們的研究結(jié)果也支持了這一結(jié)論。

PGIP是特異性的抑制劑，對(duì)病原菌endo-PG活性抑制的專一性特別強(qiáng)，其抑制強(qiáng)度因不同病原物分泌的PGs 不同而不同[27]。在對(duì)大豆PGIP的研究中發(fā)現(xiàn)，功能區(qū)單個(gè)氨基酸的改變就會(huì)致使PGIP對(duì)病原菌的PG的識(shí)辨能力發(fā)生很大的變化，同一植物的PGIP基因家族的不同成員對(duì)同一病原菌endo-PG活性的抑制作用也存在差異，大豆PGIP基因家族中至少有5個(gè)成員，其中2個(gè)對(duì)病原菌Fusarium moniliforme和Aspergillus niger分泌的PG的抑制力均存在明顯差異，這證實(shí)了PGIPs 能夠特異識(shí)別不同的PGs[28]。本研究獲得的PGIP基因，是獼猴桃PGIP基因家族的一員，對(duì)獼猴桃某一類型的病原菌可能有較好的抗病效果，應(yīng)該具有一定的應(yīng)用前景。

4 結(jié) 論

通過(guò)多次PCR分析獲得了云南野生中華獼猴桃PGIP基因的一個(gè)996 bp的目的片段，其為一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框，編碼332個(gè)氨基酸。經(jīng)核苷酸序列同源性分析，該片段與其它植物中的PGIP基因有很高的同源性，和美味獼猴桃的同源性最高（達(dá)99%）。另外，文中通過(guò)生物信息學(xué)分析，還對(duì)這個(gè)基因的編碼區(qū)、核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，并推測(cè)了其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，這為獼猴桃種質(zhì)改良和抗病育種的研究奠定了基礎(chǔ)。

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