王 淋，烏云塔娜，葉生晶

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) a.經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.林學(xué)院，湖南 長沙 410004；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院 經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；3.國家林業(yè)局杜仲工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450003；4.國家林業(yè)局中南林業(yè)調(diào)查規(guī)劃設(shè)計(jì)院，湖南 長沙 410014）

杜仲Eucommia ulmoidesOliv.別名絲楝樹皮、膠樹，為落葉喬木，其在我國的栽培面積占世界總栽培面積的90%以上，是我國特有的經(jīng)濟(jì)林樹種之一[1]。杜仲樹皮為傳統(tǒng)名貴中藥；杜仲葉富含綠原酸、京尼平苷酸等活性成分[2-3]；杜仲種仁中含有α-亞麻酸，其含量為橄欖油、茶油中的α-亞麻酸含量的8～60 倍，而其桃葉珊瑚苷含量高達(dá)11.3%，是目前同類植物中含量最高的[4]。此外，杜仲各組織器官中均含有一種重要的工業(yè)原料——杜仲膠[5]，杜仲膠的反式聚異戊二烯結(jié)構(gòu)使其具有良好的絕緣性和粘著性，因而被廣泛應(yīng)用于電器工業(yè)、化學(xué)工業(yè)和電信器材工業(yè)，故其被譽(yù)為具有良好橡塑二重性的高分子合金材料，是目前最具開發(fā)價(jià)值的溫帶膠資源[6]。

萜類物質(zhì)是植物次生代謝過程中重要的代謝產(chǎn)物，因其結(jié)構(gòu)類型豐富多樣而被稱為“terpenome”[7]。杜仲膠的主要化學(xué)成分為聚異戊二烯，屬于多萜類化合物[8]。而植物萜類化合物主要通過兩個(gè)途徑獨(dú)立合成，即位于細(xì)胞質(zhì)的甲羥戊酸（MVA）途徑和位于質(zhì)體中的甲基赤蘚醇4-磷酸（MEP）途徑[9]。作為植物萜類生物合成的重要上游調(diào)控路徑之一的MVA途徑是一個(gè)不可逆的過程：2個(gè)乙酰輔酶A（acetyl-CoA）在乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶 （acetoacetyl-CoA acethyltransferase,ACOT） 的作用下合成乙酰乙酰輔酶A（acetoacetyl-CoA），經(jīng)3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶（hydroxymethylglutaryl-CoA synthase,HMGS）的催化形成3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A （3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A, HMGCoA），再經(jīng)3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（hydroxymethylglutaryl-CoAreductase,HMGR） 的催化下生成甲羥戊酸（mevalonate, MVA），之后在MVA激酶（mevalonate kinase,MK）的作用下形成磷酸甲羥戊酸（mevalonate-5-phosphate,MVAP），接著在磷酸甲羥戊酸激酶（phosphomevalonate kinase,PMK）的作用下生成焦磷酸甲羥戊酸（mevalonate-5-diphosphate,MVAPP）， 最 終 在甲羥戊酸焦磷脫羧酶（mevalonatepyrophosphate decarboxylase,MPD） 的作用下生成萜類物質(zhì)合成前體異戊烯焦磷酸（Isopenteny, IPP）[10-13]。

本文確定了杜仲幼果和成熟果實(shí)在MVA途徑中的相關(guān)基因，并對這些基因表達(dá)量的差異情況進(jìn)行了分析，為充分挖掘杜仲膠的生物合成過程中潛在的功能基因，深入了解合成途徑中的限速步驟，解析杜仲萜類生物合成的分子機(jī)理以及為確定杜仲萜類代謝工程靶點(diǎn)提供了基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 材 料

選取國家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心“華仲6號”的杜仲幼果（授粉后50 d，杜仲膠合成第一個(gè)高峰期）、杜仲成熟果（授粉后210 d，杜仲膠合成第二個(gè)高峰期）和杜仲葉子（展葉后55 d，膠含量高）作為實(shí)驗(yàn)材料，洗凈后投入液氮中，于－80 ℃下保存以備用。

1.2 杜仲樣品RNA的提取

采用Omega公司的Plant RNA Kit試劑盒提取杜仲葉片中的總RNA，提取完畢后測定樣品A260與A280的數(shù)值，根據(jù)A260/A280的比值估測RNA的質(zhì)量，然后將能滿足實(shí)驗(yàn)要求的RNA樣品用干冰保存好，再將其送至深圳華大基因公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和基因功能注釋。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序方法

深圳華大基因公司對目的樣品的濃度及完整度進(jìn)行了檢測，符合測序要求后，采用Illumina技術(shù)開始上機(jī)測序，通過OligodT富集mRNA，并收集200～700 nt的片段；以隨機(jī)引物為接頭，將mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA；按照長度對合成的cDNA片段進(jìn)行分類，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增；對獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行Illumina測序[14-15]。

1.4 Unigene功能注釋方法和流程

本研究對杜仲果實(shí)的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測序，構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，然后對數(shù)據(jù)庫中的Unigene進(jìn)行了全面分析和注釋。功能注釋信息給出了各Unigene的蛋白功能注釋、Pathway注釋、Gene Ontology（GO）基因功能的注釋，具體流程如圖1 所示[14-15]。

圖1 數(shù)字化轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的分析流程Fig.1 Analysis process of digital transcriptome data

2 結(jié)果與分析

在杜仲幼果和成熟果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，MVA合成途徑共有6個(gè)代謝位點(diǎn)、30條Unigene被注釋（詳見圖2）。其中，代謝位點(diǎn)2.3.1.9為乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶（acetyl-CoA C-acetyltransferase,ACOT），共注釋7條；代謝位點(diǎn)2.3.3.10為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶（hydroxymethylglutaryl-CoA synthase,HMGS），共注釋3條；代謝位點(diǎn)1.1.1.34為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（hydroxymethylglutaryl-CoA reductase,HMGR），共注釋11條；代謝位點(diǎn)2.7.1.36為甲羥戊酸激酶（mevalonate kinase,MK），共注釋2條；代謝位點(diǎn)2.7.4.2為磷酸甲羥戊酸激酶（phosphomevalonate kinase,PMK），共注釋2條；代謝位點(diǎn)4.1.1.33為甲羥戊酸焦磷脫羧酶（diphosphomevalonate decarboxylase,MDP），共注釋5條。

圖2 杜仲幼果和成熟果實(shí)KEGG數(shù)據(jù)庫中的MVA途徑Fig.2 MVA pathway of young and ripe fruits in KEGG Data

2.1 杜仲乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶EuACOT的確定及其表達(dá)差異分析

杜仲乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶在杜仲幼果和成熟果實(shí)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共有7條被注釋，這些基因的編碼序列與煙草Nicotiana tabacum（AAU95619.1）、胡黃連Picrorhiza kurrooa（ABC74567.1）、油茶Camellia oleifera（ADD10719.1）、伊樂假單胞菌Sphingomonas elodea（ZP_09954590.1） 的 ACOT基因的氨基酸序列同源性均達(dá)到80%以上，故被命名為EuACOT，記為EuACOT1～7。

EuACOT在杜仲果實(shí)中的表達(dá)量見圖3。EuACOT7在杜仲幼果中不表達(dá)，只在成熟果實(shí)中表達(dá)，而其他EuACOT成員在杜仲幼果和成熟果實(shí)中均有表達(dá)，且其在幼果中的表達(dá)量大于在成熟果實(shí)中的表達(dá)量，這說明，EuACOT7為杜仲果實(shí)生長發(fā)育的晚期基因。

圖3 EuACOT 在杜仲幼果和成熟果實(shí)中表達(dá)的差異情況Fig.3 Differential expression of EuACOT in young and ripe fruits

EuACOT在杜仲幼果和成熟果實(shí)中表達(dá)的多樣性如表1。EuACOT2、EuACOT3、EuACOT4、EuACOT5、EuACOT6在杜仲幼果和成熟果實(shí)中的表達(dá)量均存在顯著差異，EuACOT在幼果中的表達(dá)量的大小順序?yàn)镋uACOT4＞EuACOT5＞EuACOT3＞EuACOT6＞EuACOT2＞EuACOT1＞EuACOT7；而在成熟果中，EuACOT4和EuACOT5基因的表達(dá)量較高。幼果中的基因表達(dá)量比成熟果實(shí)中的表達(dá)量相對高很多，說明幼果的遺傳多樣性比成熟果高很多，其表達(dá)調(diào)控模式較為復(fù)雜。

表1 EuACOT在杜仲幼果和成熟果中表達(dá)的多樣性Table 1 Diversity of EuACOT expression in young and ripe fruits

2.2 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶EuHMGS的確定及其表達(dá)差異分析

在杜仲幼果和成熟果實(shí)中共有3條EuHMGS基因被注釋，這些基因編碼序列與喜樹Camptotheca acuminate（ACD87446.1）、煙草屬觀賞煙Nicotiana langsdorf fi ixNicotiana sanderae（ABV02025.1）的HMGS基因的氨基酸序列的同源性均達(dá)到了83%～89%，記為EuHMGS1～3。

EuHMGS基因在杜仲幼果和成熟果實(shí)中的表達(dá)量見圖4。EuHMGS家族成員在杜仲幼果和成熟果實(shí)中均有表達(dá)，且幼果中的表達(dá)量均大于成熟果實(shí)中的表達(dá)量。

圖4 EuHMGS 在杜仲幼果和成熟果實(shí)中表達(dá)的差異情況Fig.4 Differential expression of EuHMGS in young and ripe fruits

EuHMGS在杜仲幼果和成熟果中表達(dá)的多樣性如表2。EuHMGS1、EuHMGS2、EuHMGS3等基因在幼果和成熟果實(shí)中的表達(dá)量均存在顯著差異，無論在幼果還是成熟果實(shí)中其表達(dá)量的大小順序均為EuHMGS1＞EuHMGS2＞EuHMGS3。

表2 EuHMGS在杜仲幼果和成熟果中表達(dá)的多樣性Table 2 Diversity of EuHMGS expression in young and ripe fruits

2.3 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶EuHMGR的確定及其表達(dá)差異分析

在杜仲幼果和成熟果實(shí)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共有11條EuHMGR基因被注釋，這些基因編碼序列與喜樹Camptotheca acuminata（P48021.1）、馬鈴薯Solanum tuberosum（P48020.1）、黃龍膽Gentianalutea（BAE92730.1）等其他植物的HMGR基因的氨基酸序列的同源性均達(dá)到80%以上，故其被命名為EuHMGR，記為EuHMGR1～11。

EuHMGR在杜仲幼果及成熟果實(shí)中的表達(dá)量如圖5所示。從圖5中可以看出，EuHMGR4、EuHMGR5基因在杜仲成熟果實(shí)中不表達(dá)，只在杜仲幼果中有特異表達(dá)，說明EuHMGR4、EuHMGR5基因?yàn)槎胖俟麑?shí)生長發(fā)育的早期基因；EuHMGR10在幼果中不表達(dá)，只在成熟果實(shí)中有特異表達(dá)，說明EuHMGR10為杜仲果實(shí)生長發(fā)育的晚期基因，也是萜類物質(zhì)大量合成時(shí)表達(dá)的基因。綜上所述，EuHMGR10在萜類化合物的生物合成中起重要作用；且EuHMGR1、EuHMGR8、EuHMGR9在成熟果實(shí)中的表達(dá)量大于幼果，EuHMGR2、EuHMGR3、EuHMGR6、EuHMGR7、EuHMGR11等基因在幼果中的表達(dá)量大于其在成熟果實(shí)中的表達(dá)量。

圖5 EuHMGR 在杜仲幼果和成熟果實(shí)中表達(dá)的差異情況Fig.5 Differential expression of EuHMGR in young and ripe fruits

EuHMGR在杜仲幼果和成熟果實(shí)中表達(dá)的多樣性如表3所示。由表3可知，EuHMGR3、EuHMGR4、EuHMGR5、EuHMGR6、EuHMGR7、EuHMGR9、EuHMGR11在杜仲幼果和成熟果中的表達(dá)量無顯著差異，而EuHMGR1、EuHMGR2、EuHMGR8、EuHMGR10在杜仲幼果和成熟果實(shí)中的表達(dá)量存在顯著差異，這說明，EuHMGR基因表達(dá)調(diào)控模式極其復(fù)雜。

2.4 甲羥戊酸激酶EuMK的確定及其表達(dá)差異分析

從杜仲幼果和成熟果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中可以發(fā)現(xiàn)，EuMK基因有2條被注釋，這些基因編碼序列與擬南芥Arabidopsis thaliana（AAD45421.1）和橡膠樹Hevea brasiliensis（AAL18925.1）等植物的MK基因的氨基酸序列的同源性均達(dá)到80%以上，故其被命名為EuMK，記為EuMK1～2。

表3 EuHMGR在杜仲幼果和成熟果中表達(dá)的多樣性Table 3 Diversity of EuHMGR expression in young and ripe fruits

EuMK在杜仲幼果與成熟果實(shí)中均有表達(dá)（見圖6），且在幼果中的表達(dá)量大于在成熟果實(shí)中的表達(dá)量。

圖6 EuMK 在杜仲幼果和成熟果實(shí)中表達(dá)的差異情況Fig.6 Differential expression of EuMK in young and ripe fruits

EuMK在杜仲幼果和成熟果實(shí)中表達(dá)的多樣性如表4所示。由表4可知，EuMK在杜仲幼果和成熟果實(shí)中的表達(dá)量均存在顯著差異。

表4 EuMK在杜仲幼果和成熟果中表達(dá)的多樣性Table 4 Diversity of EuMK expression in young and ripe fruits

2.5 磷酸甲羥戊酸激酶EuPM的確定及其表達(dá)差異分析

從杜仲幼果和成熟果實(shí)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，EuPMK基因有2條被注釋，這些基因編碼序列與煙草屬觀賞煙Nicotiana langsdorf fi ixNicotiana sanderae（ABV02027.1）、橡膠樹Hevea brasiliensis（AAL18926.1）、 茶Camellia sinensis（AFC34137.1）等植物的MK基因的氨基酸編碼序列的同源性分別為83%、77%、90%，故其被命名為EuPMK，記為EuPMK1與EuPMK2。

EuPMK在杜仲幼果和成熟果實(shí)中均有表達(dá)（見圖7），EuPMK1與EuPMK2在杜仲幼果中的表達(dá)量均大于其在成熟果中的表達(dá)量。

圖7 EuMDP在杜仲幼果和成熟果實(shí)中表達(dá)的差異情況Fig.7 Differential expression of EuMDP in young and ripe fruits

EuPMK在杜仲幼果和成熟果中表達(dá)的多樣性如表5所示。由表5可知，EuPMK1在杜仲幼果和成熟果實(shí)中的表達(dá)量均存在顯著差異，而EuPMK2在杜仲幼果和成熟果實(shí)中的表達(dá)量卻無顯著差異。

表5 EuPMK在杜仲幼果和成熟果中表達(dá)的多樣性Table 5 Diversity of EuPMK expression in young and ripe fruits

2.6 磷酸甲羥戊酸激酶EuMDP的確定及其表達(dá)差異分析

從杜仲幼果和成熟果實(shí)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，EuPMK基因有5條被注釋，這些基因編碼序列與人參Panax ginseng（ADI80345.1）、橡膠樹Hevea brasiliensis（AAL18927.1）、煙草屬觀賞煙Nicotiana langsdorf fi ixNicotiana sanderae（ABV02028.1）等植物的MDP基因的氨基酸序列的同源性均達(dá)到85%以上，故其被命名為EuMDP，記為EuMDP1～5。

EuMDP在杜仲幼果和成熟果及杜仲幼果和葉子中均有表達(dá)（詳見圖8），EuMDP家族各成員在杜仲幼果中表達(dá)量的大小順序?yàn)镋uMDP2＞EuMDP5＞EuMDP3 ＞EuMDP4＞EuMDP1；而在杜仲成熟果中，EuMDP3和EuMDP4的表達(dá)量相對較高。

圖8 EuMDP在杜仲幼果和成熟果實(shí)中表達(dá)的差異情況Fig.8 Differential expression of EuMDP in young and ripe fruits

EuMDP在杜仲幼果和成熟果中表達(dá)的多樣性如表6所示。由表6可知，EuMDP家族其他成員在幼果和成熟果實(shí)中的表達(dá)量均達(dá)到顯著差異水平。

表6 EuMDP 在杜仲幼果和成熟果中表達(dá)的多樣性Table 6 Diversity of EuMDP expression in young and ripe fruits

3 結(jié)論與討論

萜類化合物（terpenoids）是植物次生代謝產(chǎn)物中最大的一個(gè)家族，在自然界中廣泛分布，但一般萜類物質(zhì)在植物中的含量較低，難于分離純化，例如，紫杉醇在紫杉樹皮中的含量每千克只有40～100 mg[16]。本研究采用轉(zhuǎn)錄組測序方法，可以檢測到MVA途徑低表達(dá)量的基因的存在，這為進(jìn)一步分離、純化和克隆萜類物質(zhì)合成相關(guān)酶提供了依據(jù)。

萜類化合物生物合成途徑迄今已基本闡明，主要為通過細(xì)胞質(zhì)中的MVA途徑和質(zhì)體中 的MEP途徑合成，其生物合成中相關(guān)酶的克隆、表達(dá)和調(diào)控是目前研究的熱點(diǎn)。本文確定了MVA途徑的相關(guān)基因：EuACOT7條、記為EuACOT1～7；EuHMGS3條、 記 為EuHMGS1～ 3；EuHMGR11條、記為EuHMGR1～11；EuMK2條、記為EuMK1～2；EuPMK2條、記為EuPMK1～2；EuMDP5條、記為EuMDP1～5。

植物體內(nèi)許多萜烯成分通常有著復(fù)雜而獨(dú)特的生物合成途徑和迥異的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其分布通常具有種屬、器官、組織和生長發(fā)育階段的特異性[17]，這就充分說明了萜類合成酶存在表達(dá)和調(diào)控的時(shí)空特異性。乙酰COA酰基轉(zhuǎn)移酶是萜類化合物合成MVA途徑的起始酶，在不同的組織中其表達(dá)量有所不同[18]。在丹參的根、莖、葉中均有表達(dá)，但是根中的表達(dá)量明顯高于莖和葉中的表達(dá)量[19]。EuACOT家族基因在杜仲成熟果實(shí)中均有表達(dá)，除了EuACOT7，其他EuACOT成員在杜仲幼果中均有表達(dá)，且其在幼果中的表達(dá)量大于其在成熟果實(shí)中的表達(dá)量。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶是萜類物質(zhì)合成MVA途徑中重要的中間體，HMGS在不同組織部位的表達(dá)不盡相同，例如喜樹HMGS基因在子葉和胚軸中的表達(dá)量最高，而在根部幾乎不表達(dá)[20]；EuHMGS在杜仲幼果和成熟果實(shí)中均有表達(dá)，且其在幼果中的表達(dá)量大于其在成熟果實(shí)中的表達(dá)量，并且存在顯著性差異。不同物種MVA途徑關(guān)鍵酶基因的克隆與功能的研究多集中于3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶，HMGR是MVA途徑中的第一個(gè)限速酶，為細(xì)胞質(zhì)萜類代謝中的重要調(diào)控位點(diǎn)。Schaller等人[21]將HMGR的基因組片段hmg1基因轉(zhuǎn)入煙草中，使總的甾醇量增加6倍，其原因可能是hmg1表達(dá)水平的提高導(dǎo)致了相應(yīng)的HMGR酶活性的提高，并且最終產(chǎn)物在轉(zhuǎn)基因的組織中得以累積。本文對EuHMGR基因在杜仲幼果和成熟果實(shí)中表達(dá)量的差異情況進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EuHMGR4、EuHMGR5只在杜仲幼果中有特異表達(dá)，EuHMGR10只在成熟果實(shí)中有特異表達(dá)，EuHMGR1、EuHMGR2、EuHMGR3、EuHMGR6、EuHMGR7、EuHMGR8、EuHMGR9、EuHMGR11在杜仲幼果和成熟果實(shí)中均有表達(dá)。由此可見，EuHMGR表達(dá)調(diào)控模式較為復(fù)雜。EuMK、EuPMK、EuMDP家族基因在杜仲幼果和成熟果中均有表達(dá)，且其在幼果中的表達(dá)量高于其在成熟果實(shí)中的表達(dá)量。

本文首次對杜仲幼果和成熟果實(shí)MVA途徑相關(guān)基因表達(dá)的差異情況進(jìn)行了分析，分析結(jié)果為以后研究杜仲萜類物質(zhì)的生物合成機(jī)制提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 杜紅巖.我國的杜仲膠資源及其開發(fā)潛力與產(chǎn)業(yè)發(fā)展思路[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2010,28(3):1－6.

[2] 杜紅巖.杜仲活性成分與藥理研究的新進(jìn)展[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2003,21(2):58－61.

[3] 杜紅巖,劉昌勇,李 欽,等.杜仲葉中3種主要活性成分含量的季節(jié)變化[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2011,31(8): 6－9.

[4] 朱莉偉,陳素文,蔣建新,等.杜仲種仁化學(xué)成分研究[J].中國野生植物資源,2005,24(2):44－45.

[5] 彭金年.杜仲葉中杜仲膠含量與分子量分布研究[D].沈陽:沈陽藥科大學(xué),2007.

[6] 杜紅巖,胡文臻,俞 銳.杜仲產(chǎn)業(yè)綠皮書：中國杜仲橡膠資源與產(chǎn)業(yè)發(fā)展報(bào)告（2013）[M].北京:社會(huì)科學(xué)文獻(xiàn)出版社,2013:3－7.

[7] 李軍玲,羅曉東,趙沛基,等.植物萜類生物合成中的后修飾酶[J].云南植物研究,2009, 31(5):461－468.

[8] 葉生晶,烏云塔娜,田大倫,等.杜仲M(fèi)VA途徑相關(guān)基因的鑒定及熒光定量PCR引物篩選[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2013, 33(8):51－56.

[9] Newman J D, Chappell J.Isoprenoid biosynthesis in plants:carbon partitioning within the cytoplasmic pathway [J].Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 1999, 34(2):95－106.

[10] 沈少華,劉姬艷,胡江琴,等.喜樹堿生物合成途徑及其相關(guān)酶的研究進(jìn)展[J].中草藥,2001,42(9):204－210.

[11] Lichtenthaler H K.The 12deoxy2D2xylulose252phosphate pathway of isoprenoid biosynthesis in plants[J].Annu RevPlant Physiol PlantMolBiol,1999, 50: 47－65.

[12] Dudareva N, Andersson S, Orlova I,et al.The nonmevalonate pathway supports both monoterpene and sesquiterpene formation in snapdragon fl owers [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2005, 102(3): 933－938.

[13] Hemmerlin A, Hoef fl er J F, Meyer O,et al.Cross2talk between the cytosolic mevalonate and the plastidial methylerythritol phosphate pathways in tobacco bright yellow22 cells [J].Journal of Biological Chemistry, 2003, 278 (29) : 26666－26676.

[14] 李鐵柱,杜紅巖,劉慧敏,等.杜仲果實(shí)和葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝及基因功能注釋[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2012,32(11):122－130.

[15] 李鐵柱,杜紅巖,劉慧敏,等.杜仲幼果和成熟果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝及基因功能注釋[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2012,32(10): 9－17.

[16] 張長波,孫紅霞,鞏中軍,等.植物萜類化合物的天然合成途徑及其相關(guān)合酶[J].植物生理學(xué)通訊,2007,43(4):779－785.

[17] 劉蓉蓉.植物次生代謝途徑的遺傳修飾研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào),2008,(6):10－13.

[18] 張 琳,譚曉風(fēng),胡 嬌,等.油茶乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶基因cDNA克隆及序列特征分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2011, 31(8):108－112 .

[19] 崔光紅,王學(xué)勇,馮 華,等.丹參乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶基因全長克隆和SNP分析[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2012,45(6):113－118.

[20] 王 偉.喜樹毛狀根培養(yǎng)體系的建立及喜樹hmgs基因的克隆分析[D].上海:上海師范大學(xué),2009.

[21] Schaller B, Grausem P, Benveniste ML,et al.Expression of theHevea brasiliensis(H.B.K.) Mull Arg 3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A reductase 1 in tobacco results in sterol overproduction[J].Plant Physiology, 1995,56(4):89－95.