李鐵柱，杜紅巖，劉攀峰

（1.中國林業(yè)科學研究院 經(jīng)濟林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2.國家林業(yè)局 杜仲工程技術研究中心，河南 鄭州 450003）

杜仲Eucommia ulmoidesOliv.是我國特有名貴藥用樹種[1-4]，杜仲種仁中富含油脂脂肪酸，主要成分組成為豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和α-亞麻酸等6種脂肪酸組分[5]。α-亞麻酸（α-linolenic acid，ALA）在杜仲翅果種仁中含量高達66.4%[6]，是目前發(fā)現(xiàn)的植物中α-亞麻酸含量最高的木本植物之一，具有極大的開發(fā)潛力[7-11]。研究發(fā)現(xiàn)0.25～1.00 g/kg劑量的杜仲籽油可顯著降低大鼠血清甘油三酯及膽固醇含量[12-14]。

亞麻酸可分為α-亞麻酸（α-linolenic acid，ALA）和γ-亞麻酸（γ-linolenic acid，GLA）2種，它們均是18個碳原子3個雙鍵直鏈脂肪酸，相對分子質量為278[15-16]。其中，α-亞麻酸結構為順9，順12，順15十八碳三烯酸，簡記為9,12,15-18:3；γ-亞麻酸結構為順6，順9，順12十八碳三烯酸，簡記為6,9,15-18:3[17]。二者差異僅在于其中1個雙鍵位置不同。在天然油脂中，根據(jù)多不飽和脂肪酸甲基端距離最近雙鍵碳原子數(shù)的不同，將不飽和脂肪酸分為3個系列：以油酸為主的n-9系列；以亞油酸、亞油酸、花生四烯酸為主的n-6系列；以α-亞麻酸、EPA、DHA為主的n-3系列。這3個系列的脂肪酸在體內不能相互轉換。n-3系列亞麻酸可在體內代謝為EPA和DHA，所以α-亞麻酸具有類似EPA、DHA的生理功能和化學特性[18]。α-亞麻酸ALA 的生物合成途徑：硬脂酸在Δ9-脂肪酸脫氫酶的催化下生成油酸（oleic acid，OA），油酸在Δ12-脂肪酸脫氫酶的催化下生成亞油酸（linoleic acid，LA），隨后，亞油酸進入多不飽和脂肪酸代謝的n-3 途徑或直接進入n-6 途徑（見圖1）。在n-3途徑中，LA在Δ15-脂肪酸脫氫酶的催化下轉化成α-亞麻酸；而在n-6 途徑中，LA經(jīng)Δ6-脂肪酸脫氫酶的催化生成γ-亞麻酸。在上述2個反應中，Δ15-脂肪酸脫氫酶控制總反應的反應速度和方向，是ALA代謝途徑的關鍵酶[19]。文中在杜仲果實和葉片轉錄組測序的基礎上，比較分析α-亞麻酸合成途徑中的系列基因在不同器官不同時期的表達差異，旨在為杜仲α-亞麻酸生物合成的分子調控機制研究提供理論依據(jù)。

圖1 α-亞麻酸的生物合成的途徑Fig.1 The pathway of α-linolenic acid biosynthesis

1 材料與方法

分別于2010年5月28日和10月28日，在國家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心采集“華仲6號”杜仲優(yōu)良品種葉片和果實，提取RNA，送至深圳華大基因公司進行轉錄組測序和基因功能注釋[20-21]。

轉錄組測序得到的Unigene，利用NCBI網(wǎng)站上的BLAST工具，和其它物種已知的α-亞麻酸相關CDS序列進行在線比較，用相似性得分比較高的已知基因確定并命名杜仲轉錄組中的α-亞麻酸合成相關基因。基因確定后，分析該基因（或基因家族）在杜仲葉片和果實（幼嫩果實和成熟果實）中的表達量差異。

2 結果與分析

2.1 杜仲α-亞麻酸生物合成途徑中注釋的Unigene

2.1.1 杜仲幼果和成果中α-亞麻酸生物合成途徑中注釋的Unigene

杜仲幼果和成果轉錄組數(shù)據(jù)中α-亞麻酸合成途徑，從硬脂酸起始，共涉及3個代謝位點（見圖2）。位點3.1.2.2注釋有Unigene1258、Unigene18404、Unigene9145等 3條 Unigene， 其中差異表達基因有4條；位點1.14.19.1注釋有Unigene6936等4條Unigene，成熟果實特異表達有3條；位點1.14.19.-注釋有Unigene1906等6條Unigene，幼果和成果中表達水平顯著差異的有Unigene1條。

2.1.2 杜仲葉片和幼果中α-亞麻酸生物合成途徑中注釋的Unigene

杜仲葉片和幼果轉錄組數(shù)據(jù)中，α-亞麻酸合成途徑共涉及3個代謝位點。位點3.1.2.2注釋有Unigene19869、Unigene40659、Unigene40822等 3條Unigene，且均有顯著的差異表達；位點1.14.19.1注釋有Unigene6936；位點1.14.19.-注釋有Unigene63、Unigene12834等2條Unigene，其中Unigene63在杜仲葉片和幼果中表達水平有顯著差異。

2.2 杜仲α-亞麻酸生物合成關鍵酶基因的確定

2.2.1 杜仲幼果和成果中α-亞麻酸生物合成關鍵酶基因的確定

杜仲幼果和成果的轉錄組數(shù)據(jù)經(jīng)過進一步BLAST分析后發(fā)現(xiàn)，Unigene1906、Unigene14989、Unigene18329等6條Unigene與茄子等植物的δ-15脂肪酸脫氫酶相似性達到55%～86%，其中Unigene14989為δ-15脂肪酸脫氫酶全長cDNA；Unigene6936、Unigene47927等 4條 Unigene與 油桐等植物的δ-9脂肪酸脫氫酶相似性達到71%～91%，其中Unigene47927為δ-9脂肪酸脫氫酶全長cDNA；Unigene1258、Unigene18404、Unigene9145與擬南芥等植物的?；鵆oA硫酯酶相似性達到69%～81%，Unigene18404為?；鵆oA硫酯酶全長cDNA（見表1）。

圖2 KEGG數(shù)據(jù)庫中的亞麻酸生物合成途徑Fig.2 The KEGG pathway of α-linolenic acid biosynthesis

表1 杜仲幼果和成熟果α-亞麻酸合成途徑中相關酶基因和對應Unigene相似度信息Table 1 The related enzyme genes and of corresponding Unigene similarity information in α-linolenic acid synthesis pathway in Eucommia ulmoides young fruit and mature fruit

2.2.2 杜仲幼果和葉片中α-亞麻酸生物合成相關酶基因的確定

杜仲幼果和葉片的轉錄組數(shù)據(jù)經(jīng)過進一步BLAST分析后發(fā)現(xiàn)，Unigene63、Unigene12843與其它植物種的δ-15脂肪酸脫氫酶基因相似性分別達到79%和55%；Unigene10591與其它植物種的δ-9脂肪酸脫氫酶相似性達到73%；Unigene19869與其它植物種的?；鵆oA硫酯酶相似性達到70%（見表2）。

2.3 杜仲EuFatA基因的表達差異

轉錄組分析結果表明，杜仲幼果和成熟果實中FatA獲得3個拷貝，但序列比對后發(fā)現(xiàn)，3條FatA基因Unigene序列與葡萄的acyl-coenzyme A thioesterase 8 完全相同（見表3），故命名為EuFatA8。

基因表達量差異分析結果表明，3條FatA基因的Unigene表達量差異未達到顯著水平，見表4和圖3。

表2 杜仲幼果和葉片α-亞麻酸合成途徑中相關酶基因和對應Unigene相似度信息Table 2 The related enzyme genes and of corresponding Unigene similarity information in α-linolenic acid synthesis pathway in Eucommia ulmoides young fruit and leaf

表4 EuFatA相關Unigene在杜仲幼果和成熟果中的表達量Table 4 Expression of related EuFatA Unigene in young fruit and mature fruit

圖3 EuFatA相關Unigene在杜仲幼果和成熟果中的表達差異Fig.3 Expression difference of related EuFatA Unigene in young fruit and mature fruit

2.4 杜仲EuSAD基因的表達差異

硬脂酰-ACP去飽和酶（stearoyl-ACP desaturase，SAD），它是唯一一個可溶的去飽和酶，存在于質體中。在脂肪酸形成甘油脂之前，SAD催化引入第1個雙鍵[22-23]。在杜仲的幼果和成熟果實中有被注釋為SAD基因的Unigene共4有條，分別命名為EuSAD1～EuSAD4（見表5）。

表5 杜仲δ-9脂肪酸脫氫酶基因的多樣性Table 5 Diversity of EuSAD genes

表達差異分析結果表明，EuSAD1～EuSAD4在成熟果實中均有表達，但只有EuSAD1的表達量較高，其它3個微量表達；而在幼果中只有EuSAD1表達，且表達量較高。EuSAD1在幼果中的表達量高于成熟果實，見表6和圖4。推斷杜仲幼果和成熟果實的SAD基因均以EuSAD1為主。

表6 SAD相關Unigene在杜仲幼果和成熟果中的表達量Table 6 Expression of related EuSAD Unigene in young fruit and mature fruit

2.5 杜仲EuFAD2基因的表達差異

在杜仲幼果和成熟果實中δ-12脂肪酸脫氫酶（FAD2）有5個拷貝（見表7），分別命名為EuFAD2-1～EuFAD2-5。

圖4 SAD相關Unigene在杜仲幼果和成熟果中的表達差異Fig.4 Expression difference of related SAD Unigene in young fruit and mature fruit

表7 杜仲δ-12脂肪酸脫氫酶基因的多樣性Table 7 Diversity of EuFAD2 genes

EuFAD2-1和EuFAD2-2這2條FAD2基因在杜仲幼果和成熟果實中的表達量差異達到顯著水平，其余3條EuFAD2基因的表達量無顯著差異；幼果中EuFAD2-4、EuFAD2-5的表達量超過成熟果實。

FAD2基因根據(jù)其在成熟果實中表達量由大到小排列依次為EuFAD2-1、EuFAD2-2、EuFAD2-3、EuFAD2-4、EuFAD2-5，根據(jù)其在幼果中的表達量由大到小依次為EuFAD2-2、EuFAD2-1、EuFAD2-4、EuFAD2-3、EuFAD2-5（見表8和圖5）。

表8 δ-12脂肪酸脫氫酶相關Unigene在杜仲幼果和成熟果中的表達量Table 8 Expression of related EuFAD2 Unigene in young fruit and mature fruit

圖5 EuFAD2相關Unigene在杜仲幼果和成熟果中的表達差異Fig.5 Expression difference of related EuFAD2 Unigene in young fruit and mature fruit

2.6 杜仲 EuFAD3基因的多樣性和表達調控規(guī)律

轉錄組分析結果表明，在杜仲成熟果實和幼果中α-亞麻酸生物合成關鍵酶基因FAD3共有6個拷貝，分別命名為EuFAD3-1-EuFAD3-6（見表9）。

表9 杜仲ω-3脂肪酸脫氫酶基因的多樣性Table 9 Diversity of EuFAD3 genes

對表達差異的研究結果表明，6個FAD3基因中只有EuFAD3-6在成熟果實和幼果中具有顯著的表達差異（見表10）。而且在成熟果實中表達量比幼果高出3.56倍（見圖6）；而EuFAD3-1～EuFAD3-5的表達量均未達到顯著水平。

表10 δ-15脂肪酸脫氫酶相關Unigene在杜仲幼果和成果中的表達量Table 10 Expression of related EuFAD3 Unigene in young fruit and mature fruit

圖6 δ-15脂肪酸脫氫酶相關Unigene在杜仲幼果和成果中的表達差異Fig.6 Expression difference of related EuFAD3 Unigene in young fruit and mature fruit

EuFAD3-1～EuFAD3-6根據(jù)其在幼果中的表達量由大到小排序依次為：EuFAD3-2、EuFAD3-1、EuFAD3-3、EuFAD3-5、EuFAD3-4、EuFAD3-6；依據(jù)其在成熟果實中的表達量由大到小排序依次為：EuFAD3-1、EuFAD3-2、EuFAD3-3、EuFAD3-4、EuFAD3-5、EuFAD3-6；在成熟果實中EuFAD3-1、EuFAD3-4、EuFAD3-5、EuFAD3-6等4個EuFAD基因的表達量均超過幼果，這與成熟果實的α-亞麻酸含量遠超過幼果的情況基本一致。

3 結論與討論

文中研究了杜仲α-亞麻酸合成途徑重要基因的遺傳多樣性和表達規(guī)律，并鑒定了全長cDNA。在幼果和成熟中獲得α-亞麻酸合成相關酶13條，其中差異表達基因6條，葉片和幼果獲得6條基因，差異表達3條；?；鵄CP硫脂酶（FatA）基因在幼果和成熟果實表達量無顯著差異；硬脂酰-ACP去飽和酶（SAD）基因由4個家族成員（EuSAD1-EuSAD4）組成，在成熟果實中均有表達，而幼果中只有EuSAD1表達，EuSAD1在幼果和成熟果實中表達量無顯著差異，但幼果表達量較高，幼果還是成熟果實均以EuSAD1為主；δ-12脂肪酸脫氫酶（FAD2）基因遺傳多樣性較高，由5個家族成員（EuFAD2-1-EuFAD2-5）組成，EuFAD2-1和EuFAD2-2在幼果和成熟果實中表達量達到顯著水平，EuFAD2-1-EuFAD2-3的表達量果實高于葉片，而EuFAD2-4和EuFAD2-5幼果高于成熟果實，作用機理較復雜；ω-3脂肪酸脫氫酶（FAD3）基因家族由6個成員組成（EuFAD3-1-EuFAD3-6），只有EuFAD3-6表達量具有顯著差異，且成熟果實比高出3.56倍，而EuFAD3-1～EuFAD3-5表達量均未達到顯著水平，成熟果實EuFAD3-1、EuFAD3-4-EuFAD3-6等4個基因表達量超過幼果，這可能與成熟果實α-亞麻酸含量遠高于幼果的情況一致。

杜仲籽油不飽和脂肪酸含量達91.18%，其中α-亞麻酸高達67.60%，α-亞麻酸被世界衛(wèi)生組織確定為人體自身不能合成的必需脂肪酸，具有促進腦發(fā)育、增強智力，保護視力，降血脂，降血壓，抑制血栓性疾病，預防心肌梗塞和腦梗塞，抑制過敏，抑制癌癥的發(fā)生和轉移、抗衰老等多種功能；α-亞麻酸ALA的生物合成途徑：硬脂酸在Δ9-脂肪酸脫氫酶的催化下生成油酸，油酸在Δ12-脂肪酸脫氫酶的催化下生成亞油酸，隨后，亞油酸進入多不飽和脂肪酸代謝的n-3途徑或直接進入n-6途徑。在n-3途徑中，LA在Δ15-脂肪酸脫氫酶的催化下轉化成α-亞麻酸；而在n-6途徑中，LA經(jīng)Δ6-脂肪酸脫氫酶的催化生成γ-亞麻酸。α-亞麻酸合成過程中的關鍵酶基因中FatA的遺傳多樣性較低，不同植物中保守性較強，而SAD、FAD2和FAD3遺傳多樣性都較高，如杜仲中SAD至少包含4個成員，F(xiàn)AD2至少包含5個家族成員，F(xiàn)AD3至少包含6個成員，而且這些家族成員的表達模式及不同器官中的表達特異性均不一致，表現(xiàn)出了亞麻酸合成過程中的多樣化及復雜性。如杜仲成熟果實中3個SAD基因均表達，而幼果中只有EuSAD1表達，F(xiàn)AD2的5個家族成員EuFAD2-1和EuFAD2-2在幼果和成熟果實中表達量達到顯著水平，EuFAD2-1-EuFAD2-3的表達量果實高于葉片，而EuFAD2-4和EuFAD2-5幼果高于成熟果實，作用機理較復雜，F(xiàn)AD3基因家族由6個成員組成，僅有EuFAD3-6表達量具有顯著差異，且成熟果實比幼果高，成熟果實中大部分基因如EuFAD3-1、EuFAD3-4-EuFAD3-6等基因表達量超過幼果，這可能與成熟果實α-亞麻酸含量遠高于幼果的情況一致，另一方面表現(xiàn)出了該基因在亞麻酸合成過程的調控的復雜性，需要進一步研究。

參考文獻：

[1] 李時珍.本草綱目[M].北京:北京出版社,1995:1590－1596.

[2] 賀義昌.杜仲葉中綠原酸和蘆丁的提取分離及純化[D].長沙:中南林業(yè)科技大學,2012.

[3] 杜紅巖,李 欽,傅建敏,等.杜仲雄花茶的食品安全性毒理學[J].中南林業(yè)科技大學學報,2008,28(2):91－94.

[4] 杜紅巖,李 欽,劉攀峰,等.不同變異類型杜仲皮及再生皮中木脂素類成分含量比較[J].中南林業(yè)科技大學學報,2010,30(7): 38－42.

[5] 段小華,鄧澤元,朱 篤.杜仲種子脂肪酸及氨基酸分析[J].食品科學,2010,(4):214－217.

[6] 趙德義,徐愛遐,張博勇,等.杜仲籽油與紫蘇籽油脂肪酸組成的比較研究[J].西北植物學報,2005,(1):191－193.

[7] 李麗萍,韓 濤.富含α-亞麻酸植物資源的開發(fā)與利用[J].食品科學,2007,(11):614－618.

[8] 吳麗雅,黃 群,余 佶,等.杜仲籽油混合脂肪酸制備工藝優(yōu)化及脂肪酸組成分析[J].食品工業(yè)科技,2013,(14):287－291.

[9] 歐陽輝.從杜仲翅果中提取果仁油、桃葉珊瑚苷和杜仲膠的工藝研究[D].長沙:湖南中醫(yī)藥大學,2012.

[10] 杜紅巖.我國的杜仲膠資源及其開發(fā)潛力與產(chǎn)業(yè)發(fā)展思路[J].經(jīng)濟林研究,2010,28(3):1－3.

[11] 杜紅巖, 胡文臻, 俞 銳.中國杜仲橡膠資源與產(chǎn)業(yè)發(fā)展報告[R].北京:社會科學文獻出版社,2013:133－134.

[12] 郭美麗,周燕平.杜仲籽油輔助降血脂作用實驗研究[J].中國預防醫(yī)學志,2008,9(7):677－678.

[13] 薛程遠,曲范仙,劉 輝,等.杜仲葉乙醇提取物對小鼠免疫功能的影響[J].甘肅中醫(yī)學院學報,1998,15(3):50－52.

[14] San Giovanni J P, Chew E Y.The role of omega-3 long-chain polyunsaturated Fatty acids in health and disease of the retina [J].Progress in Retina and Eye Research,2005,24(1): 87－138.

[15] 蔡雙蓮,李 敏.多不飽和脂肪酸的研究進展[J].生命科學研究,2003,(4):289－292,304.

[16 Shark A H, Crawford M A, Reifen R.Update on alpha-linelic acid[J].Nutrition Reviews,2008,66(6):326－332.

[17] 周同永,任 飛,鄧 黎,等.γ-亞麻酸及其生理生化功能研究進展[J].貴州農(nóng)業(yè)科學,2011,(3):53－58.

[18] 陶國琴,李 晨.α-亞麻酸的保健功效及應用[J].食品科學,2000,(12):140－143.

[19] 范文洵.α-亞麻酸及其代謝產(chǎn)物EPA和DHA[J].生理科學進展,1988,(2):110－113.

[20] 李鐵柱,杜紅巖,劉慧敏,等.杜仲果實和葉片轉錄組數(shù)據(jù)組裝及基因功能注釋[J].中南林業(yè)科技大學學報,2012,32(11):122－130.

[21] 李鐵柱,杜紅巖,劉慧敏,等.杜仲幼果和成熟果實轉錄組數(shù)據(jù)組裝及基因功能注釋[J].中南林業(yè)科技大學學報,2012,32(10): 9－17.

[22] 張黨權,譚曉風,謝祿山,等.油茶EST文庫中不飽和脂肪酸合成關鍵酶基因的序列分析(英文)[J].經(jīng)濟林研究,2007,25(2):5－8.

[23] 盧善發(fā).植物脂肪酸的生物合成與基因工程[J].植物學通報,2000,(6):481－491.