陳良恩，吳峰，辛益妹，趙安東，王永新，詹皓

現(xiàn)代高性能戰(zhàn)斗機在機動飛行中所產(chǎn)生的正加速度(+Gz)具有高G值、快增長率、長持續(xù)時間以及反復出現(xiàn)等特點，高+Gz暴露引起的心臟改變對飛行員的身心健康和飛行安全具有潛在威脅[1]。動物實驗證實，重復高強度+Gz暴露可導致肌原纖維變性、線粒體腫脹、溶酶體破裂以及閏盤結構解離等多種超微結構損傷[2-4]。+Gz暴露對心肌的損傷除了機械性作用外，+Gz作用下的強烈應激反應、心肌缺血缺氧以及氧自由基大量生成也是導致心肌損傷的重要因素[5-6]。

近年來，中草藥在氧自由基清除以及對抗心肌缺血缺氧損傷等方面的作用受到越來越多的關注。本研究采用的復方中藥天芪航力片主要由紅景天、黃芪、當歸、白芍、丹參等成分組成，具有清除氧自由基、改善微循環(huán)及心血管功能、增強免疫力、提高機體抗應激能力等作用。我們曾研究報道過天芪航力片對持續(xù)高+Gz應激所致大鼠心、腦損傷的防護效果[7-8]。在本研究中，我們利用動物離心機模型，通過觀察該復方中藥制劑對大鼠心肌線粒體呼吸功能、抗氧化能力和ATP酶活性的影響，進一步探索天芪航力片對高+Gz應激致大鼠心肌損傷的防護效果及其可能機制，以期為利用中藥復方制劑提高飛行員加速度耐力的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康成年雄性SD大鼠72只，體重200±25g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。將大鼠隨機分為空白對照組、應激對照組、高+Gz應激組、復方低劑量組、復方中劑量組和復方高劑量組，每組12只，各組動物分籠飼養(yǎng)并做標記。各組動物每天上午灌胃給藥1次，連續(xù)14d，給藥體積為20ml/kg，每只動物每天灌胃前稱取體重以確定灌藥量，復方低劑量組、復方中劑量組和復方高劑量組大鼠分別按0.75、1.5和3.0g/kg給予天芪航力片制劑(由中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所化學室提供)，其余3組動物每天給予等量生理鹽水。末次給藥當日20:00開始禁食，次日進行離心機暴露。

1.2 動物離心機暴露 采用動物離心機進行+Gz暴露。將大鼠束縛固定在通氣的動物艙中，置于離心機轉臂上，大鼠頭部朝向離心機旋轉軸心，離心機半徑2m，由計算機進行加速度程序控制?？瞻讓φ战M不做任何處理；應激對照組動物在離心機艙內轉臂上束縛5min，不做離心處理；其余實驗組大鼠+10Gz暴露，持續(xù)5min，加速度增長率為1G/s。

1.3 心肌線粒體制備 大鼠高+Gz應激后4h麻醉，速取心臟，用4℃生理鹽水沖洗，取每只大鼠左室心尖部心肌組織，置于預冷的分離介質(0.25mol/L蔗糖、0.01mol/L Tris-HCl，pH7.4)中洗去血液，充分剪碎、勻漿。采用差速離心法分離線粒體。以700×g離心7min，棄沉淀；上清經(jīng)10 000×g離心10min，棄上清；用分離介質懸浮沉淀，以同樣高速離心1次，以分離介質懸浮沉淀，制成線粒體懸液，調整蛋白濃度在10~20mg/ml。以上操作均在0~4℃進行。

1.4 心肌組織線粒體呼吸功能的測定 采用Clark氧電極法測定心肌線粒體呼吸功能[9]。反應總體積2.5ml，溫度30℃，將2.4ml反應介質(0.25mol/L蔗糖，0.01mol/L Tris-HCl，0.1%BSA，0.5mmol/L EDTA，3mmol/L KH2PO4，pH7.4)加入反應池中孵育2min，然后加入線粒體懸液(0.1ml)至終濃度0.4mg/ml，記錄一段基線(1~2min)，待內源底物耗盡，基線基本平直，加入底物琥珀酸鈉至終濃度5mmol/L(10μl)，測量變2min，加入ADP至終濃度180μmol/L(9μl)，測量變10min。觀察線粒體呼吸態(tài)的變化，記錄氧耗曲線，計算在ADP加入后[Ⅲ態(tài)呼吸(state 3 respiration，ST3)]和ADP耗盡后[Ⅳ態(tài)呼吸(state 4 respiration，ST4)]的氧耗量。呼吸控制率(respiratory control ratio，RCR)以Ⅲ、Ⅳ態(tài)耗氧之比(ST3/ST4)表示。

1.5 心肌線粒體抗氧化能力及ATP酶活性測定取制備好的線粒體懸液，用超聲粉碎機使線粒體破碎，BCA法測定蛋白含量，測定試劑盒購自北京賽馳生物科技有限公司，測定步驟按照試劑盒說明書進行。過氧化氫酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性及丙二醛(MDA)含量檢測均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒完成，測定步驟按照試劑盒說明書進行。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)結果以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠心肌線粒體呼吸功能的變化 高+Gz應激組大鼠心肌線粒體ST3和RCR明顯低于空白對照組和應激對照組(P<0.01)，而ST4明顯高于空白對照組(P<0.05)，說明高+Gz應激會損傷大鼠線粒體的呼吸功能。復方中藥天芪航力片預處理后大鼠ST3和RCR升高，且呈現(xiàn)劑量依賴關系。復方高劑量組大鼠心肌線粒體ST3和RCR明顯高于高+Gz應激組(P<0.01)，ST4在高+Gz應激組和復方中藥處理組間差異無統(tǒng)計學意義(表1)。

2.2 各組大鼠心肌線粒體抗氧化能力的變化 與空白對照組和應激對照組相比，高+Gz應激組大鼠心肌線粒體SOD、GSH-Px活性明顯降低(P<0.05或P<0.01)，MDA含量顯著升高(P<0.01)，提示高+Gz應激會導致線粒體抗氧化酶的活性降低，脂質過氧化反應增強。復方中藥天芪航力片以劑量依賴方式提高CAT、SOD和GSH-Px的活性，降低MDA的含量。復方高劑量組大鼠心肌線粒體抗氧化酶活性明顯高于高+Gz應激組(P<0.05或P<0.01)，MDA含量不但低于高+Gz應激組，還明顯低于空白對照組和應激對照組(P<0.01，表2)。

2.3 各組大鼠心肌線粒體Na＋-K＋-ATP酶、Ca2＋-ATP酶活性變化 如表3所示，高+Gz應激導致Na＋-K＋-ATP酶和Ca2＋-ATP酶活性降低，但只有Na＋-K＋-ATP酶與空白對照組或應激對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。復方中藥天芪航力片能以劑量依賴方式提高ATP酶活性，復方高劑量組Na＋-K＋-ATP酶和Ca2＋-ATP酶活性都明顯高于高+Gz應激組(P<0.01)，Ca2＋-ATP酶活性甚至高于空白對照和應激對照組(P<0.05)。

表1 各組大鼠心肌線粒體呼吸功能的比較(±s, n=12)Tab.1 Comparison of respiratory function of myocardial mitochondria in each group of rats (±s, n=12)

表1 各組大鼠心肌線粒體呼吸功能的比較(±s, n=12)Tab.1 Comparison of respiratory function of myocardial mitochondria in each group of rats (±s, n=12)

ST3. State 3 respiration; ST4. State 4 respiration; RCR. Respiratory control ratio. (1)P<0.05, (2)P<0.01 compared with blank control group; (3)P<0.05, (4)P<0.01 compared with stress control group; (5)P<0.05, (6)P<0.01 compared with high +Gz stress group

Group ST3(nmol·min-1·mg protein-1)ST4(nmol·min-1·mg protein-1) RCR Blank control group 36.38±8.18 12.08±2.47 3.16±1.11 Stress control group 32.93±8.87 13.46±3.82 2.55±0.71(1)High +Gz stress group 20.99±6.45(2)(4) 16.01±3.92(1) 1.42±0.73(2)(4)Low dose compound group 25.24±7.51(2)(3) 15.65±4.44(1) 1.65±0.44(2)(4)Medium dose compound group 27.86±9.90(1)(5) 15.41±5.91 1.90±0.59(2)(3)High dose compound group 33.97±4.33(6) 14.58±3.49 2.45±0.67(1)(6)

表2 各組大鼠心肌線粒體抗氧化酶活性和MDA含量的比較(x±s, n=12)Tab.2 Comparison of antioxidase activity and MDA content of myocardial mitochondria in each group of rats (x±s, n=12)

表3 各組大鼠心肌線粒體ATP酶活性比較(U/mg protein,±s, n=12)Tab.3 Comparison of ATPase activity of myocardial mitochondria in each group of rats (U/mg protein,±s, n=12)

表3 各組大鼠心肌線粒體ATP酶活性比較(U/mg protein,±s, n=12)Tab.3 Comparison of ATPase activity of myocardial mitochondria in each group of rats (U/mg protein,±s, n=12)

(1)P<0.05 compared with blank control group; (2)P<0.05 compared with stress control group; (3)P<0.05, (4)P<0.01 compared with high +Gz stress group

Group Na＋-K＋-ATPase Ca2＋-ATPase Blank control group 2.63±0.52 2.18±0.59 Stress control group 2.56±0.23 2.14±0.49 High +Gz stress group 2.14±0.46(1)1.79±0.41 Low dose compound group 2.50±0.79 2.48±0.67(3)Medium dose compound group 2.47±0.58 2.59±0.79(3)High dose compound group 2.91±0.54(4) 2.67±0.63(1) (2) (4)

3 討 論

無論是高+Gz作用導致的心肌缺血缺氧，還是機體強烈的應激反應，均可引起心肌細胞的自由基代謝異常、能量代謝障礙以及離子平衡紊亂，損傷心肌細胞的結構和功能[10]。心肌線粒體是心肌細胞的能量代謝中心，同時也是氧自由基產(chǎn)生的主要部位，在高+Gz暴露損傷心肌細胞的過程中，線粒體首當其沖。

有氧呼吸是線粒體能量產(chǎn)生的主要過程。在線粒體呼吸過程的5個狀態(tài)中，比較重要的是ST3和ST4。ST3反映ADP和呼吸底物同時存在時的快速氧化過程，當ADP耗盡，線粒體呼吸進入ST4，ST4反映線粒體膜通透性的大小[11]。RCR是測量底物氧化和磷酸化偶聯(lián)的指標，可反映線粒體結構完整性和氧化磷酸化偶聯(lián)程度[12]。高+Gz應激大鼠心肌線粒體呼吸功能參數(shù)的變化說明線粒體氧化磷酸化功能受損，氧利用效率降低，ATP產(chǎn)生減少。復方中藥天芪航力片可以提高大鼠ST3和RCR值，其中復方高劑量組ST3和RCR值明顯高于高+Gz應激組，說明藥物對高+Gz應激大鼠心肌線粒體呼吸功能損傷有明顯的改善作用。

高+Gz應激導致心肌缺血缺氧以及兒茶酚胺類激素水平升高，從而使氧自由基的產(chǎn)生增多。體內氧自由基的清除主要有兩種方式，一種是依賴抗氧化酶類的作用，一種是依賴谷胱甘肽、維生素C、維生素E、類胡蘿卜素以及其他脂溶性抗氧化物。主要的抗氧化酶有SOD、GSH-Px及CAT。SOD催化超氧自由基生成氧和H2O2。GSH-Px負責清除氫過氧化物，催化氫過氧化物生成H2O2。因此，GSHPx可以保護膜脂質、蛋白和核酸不被氧化。CAT的主要作用是降解H2O2生成H2O和O2[13]。在本研究中，高+Gz暴露后過多的氧自由基導致了抗氧化酶活性的降低和MDA含量的升高。復方中藥天芪航力片能夠增強抗氧化酶的活性，復方高劑量組大鼠心肌線粒體抗氧化酶活性明顯高于高+Gz應激組，SOD活性甚至高于空白對照組。由于氧自由基被清除，脂質過氧化反應被抑制，心肌線粒體MDA含量也相應降低。

無論是線粒體呼吸功能受損引起的ATP生成減少還是氧自由基產(chǎn)生增多導致的脂質過氧化反應均可影響線粒體膜上ATP酶的活性以及線粒體內外的離子轉運[14-15]。本研究對Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的檢測結果也顯示，高+Gz應激可誘導降低上述ATP酶的活性，但Ca2+-ATP酶活性在空白對照組、應激對照組及高+Gz應激組間差異無統(tǒng)計學意義，其原因可能與實驗動物的數(shù)量較少有關。生理情況下，線粒體通過膜上Ca2+-ATP酶主動將Ca2+從胞質攝入線粒體基質，參與細胞代謝調節(jié)。當Ca2+-ATP酶活性下降時，線粒體攝取Ca2+減少，胞質中Ca2+增加時，細胞代謝受到影響，甚至死亡。Na+-K+-ATP酶與Ca2+-ATP酶共同維持線粒體容量、內外離子平衡和滲透壓。Na+-K+-ATP酶活性降低可引起線粒體內Na+潴留，線粒體腫脹甚至破裂。復方中藥天芪航力片能夠明顯提高線粒體Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性，有助于維持線粒體內外離子的平衡，避免和減輕離子轉運障礙對線粒體以及心肌細胞的損傷。

總之，本研究結果顯示復方中藥天芪航力片可以改善線粒體呼吸功能、增強線粒體抗氧化能力、提高ATP酶的活性，對高+Gz應激導致的心肌線粒體功能損傷起保護作用。進一步研究復方中藥的保護機制和臨床效果，盡早將其應用于飛行人員，提高飛行人員的抗荷耐力，對于保證飛行安全具有重要意義。

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