劉小甜，楊明英，鄧連霞，朱良均

（浙江大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院應(yīng)用生物資源研究所，浙江 杭州，310058）

1 前言

組織工程技術(shù)是一項(xiàng)用于治療組織和器官缺損的新手段，該技術(shù)通過(guò)運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)的原理與技術(shù)，設(shè)計(jì)、構(gòu)建、改良和培養(yǎng)生物活體組織，以修復(fù)和重建組織器官的結(jié)構(gòu)和功能[1]。組織工程技術(shù)的核心是建立由細(xì)胞和生物材料構(gòu)成的三維空間復(fù)合體。其中，支架材料是該復(fù)合體的主要元素之一，其主要作用包括：①為細(xì)胞粘附提供物理支撐，以支持新生組織的生長(zhǎng)，并能被生物降解；②為細(xì)胞增殖、分化、代謝提供空間；③提供特定的宏觀、微觀結(jié)構(gòu)，引導(dǎo)細(xì)胞構(gòu)建特定功能的組織或器官；④傳遞化學(xué)或力學(xué)信號(hào)，調(diào)控細(xì)胞的形狀。

絲素是蠶絲的一種天然高分子纖維蛋白，含量約占蠶絲的70%～80%，含有18種氨基酸，其中甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸約占總組成的80%以上。Altman等[2]認(rèn)為絲素蛋白具有如下優(yōu)點(diǎn)：①與其他天然纖維和許多高性能合成纖維相比，有獨(dú)特的力學(xué)性能；②在外科領(lǐng)域的應(yīng)用已有很長(zhǎng)歷史；③可加工成膜、顆粒、纖維、支架等多種形態(tài)，加工工藝相對(duì)簡(jiǎn)單；④可通過(guò)某些氨基酸的氨基和側(cè)鏈的化學(xué)修飾，較容易地改變表面性能；⑤在體內(nèi)外可以緩慢降解；⑥對(duì)生物體無(wú)危險(xiǎn)性，對(duì)其免疫系統(tǒng)的副反應(yīng)較小。因此，絲素蛋白已被廣泛應(yīng)用于組織工程的研究。

2 絲素蛋白支架的生物相容性

組織工程支架材料的生物相容性，包括生物降解性、結(jié)構(gòu)相容性和細(xì)胞相容性等多方面的要求。支架材料的生物降解性，包括生物可降解程度、降解速率影響因素、降解機(jī)理等。結(jié)構(gòu)相容性是指，為了滿足生理負(fù)荷的需要，支架應(yīng)提供暫時(shí)性的物理支持以承受外部和內(nèi)部的應(yīng)力直至新生組織形成，因而必須與新生組織以及機(jī)體的植入部位達(dá)到一定的力學(xué)匹配。細(xì)胞相容性包括細(xì)胞在材料上的黏附，遷移，增殖，分化，凋亡等情況。本文重點(diǎn)介紹絲素支架材料的結(jié)構(gòu)相容性和細(xì)胞相容性的研究情況。

2.1 絲素支架材料的結(jié)構(gòu)相容性

劉洋等[4]以犬牙周膜細(xì)胞為種子細(xì)胞，以殼聚糖—絲素蛋白—磷酸三鈣復(fù)合物作為支架材料，研究該材料用于牙周組織工程的特征。研究表明，以犬牙周膜細(xì)胞為種子細(xì)胞，殼聚糖—絲素蛋白—磷酸三鈣復(fù)合物支架材料與單純殼聚糖支架材料相比，有更適宜的多孔結(jié)構(gòu)及較理想的骨誘導(dǎo)作用，具有更強(qiáng)的結(jié)構(gòu)相容性和再生能力，可作為牙周組織再生的理想支架材料。

鞠剛等[5]用軟骨誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞接種于絲素蛋白/羥基磷灰石支架材料上，發(fā)現(xiàn)復(fù)合材料無(wú)論是在機(jī)械強(qiáng)度上還是誘導(dǎo)分化上均比單一材料更符合軟骨組織的生理結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)，新生的組織在大體和組織形態(tài)上類似正常軟骨組織，能夠形成透明軟骨，修復(fù)動(dòng)物膝關(guān)節(jié)全層軟骨缺損，重建關(guān)節(jié)的解剖結(jié)構(gòu)和功能。脂肪干細(xì)胞和SF/HA復(fù)合支架體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的軟骨樣組織和軟骨下骨組織與周圍正常組織融合良好，為今后組織工程修復(fù)軟骨中復(fù)合材料的應(yīng)用進(jìn)行了新的嘗試并提供了可能性。

Sarmistha Talukdar等[6]用冷凍干燥法制得絲素蛋白三維支架，研究了支架與接種細(xì)胞的密度之間的相互影響。結(jié)果表明，絲素蛋白支架作為一個(gè)細(xì)胞相容性良好的載體，能夠克服潛在的不足，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)增有良好的支持作用。而接種細(xì)胞的密度對(duì)材料的生物化學(xué)和生物力學(xué)方面的特性也有顯著地實(shí)質(zhì)性影響，在一定范圍內(nèi)，密度越大，材料的韌性越好。

Mengqing Zang等[7]通過(guò)冷凍干燥法制得了導(dǎo)管狀的絲素—?dú)ぞ厶腔旌现Ъ?，將鼠的軟骨?xì)胞接種在支架上，并將支架用一層軟骨膜包裹，培養(yǎng)6周后將所得到的支架—細(xì)胞—軟骨膜材料移植到裸鼠背部皮下袋中，試驗(yàn)結(jié)果表明所得的支架—細(xì)胞—軟骨膜材料在小鼠體內(nèi)雖然并未形成類似天然的導(dǎo)管，但該支架材料具有良好的生物相容性，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)增使其具有極好的力學(xué)性能，向氣管移植方面研究出類似天然氣管的功能支架材料邁進(jìn)了一步。

Nandana Bhardwaj等[8]制備了絲素和殼聚糖的多孔聚電解質(zhì)混合物，電鏡下觀察材料的孔徑為100～160 μm，具有良好的相互連通性，高孔隙率和適宜的抗菌性。與單一材料相比較而言，材料呈現(xiàn)出較高的抗壓強(qiáng)度和彈性模量，且促進(jìn)貓的成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)和粘附，具有良好的生物相容性，是一種很有前景的軟骨組織工程材料。

Jiankang He等[9]用自上而下組裝的方法制得絲素—明膠微流體復(fù)合支架材料。研究表明SF/G比例為2∶2時(shí)，復(fù)合材料具有較好的結(jié)構(gòu)特征，機(jī)械性能和生物學(xué)特性。材料中的微流體孔道在由上而下組裝的過(guò)程中保持良好并互相連通。研究設(shè)想若將微流體孔道中灌注培養(yǎng)基來(lái)提高材料的養(yǎng)分和含氧量，則材料有望用作厚組織工程材料。

2.2 絲素支架材料的細(xì)胞相容性

佘榮峰等[10]將兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)、誘導(dǎo)后，與絲素蛋白/殼聚糖三維支架材料體外共培養(yǎng)。研究表明，經(jīng)誘導(dǎo)后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在支架材料上黏附、生長(zhǎng)良好，材料無(wú)細(xì)胞毒性，保持正常的分裂增殖速度；隨時(shí)間的增加，細(xì)胞黏附率增加，材料組較對(duì)照組黏附率強(qiáng)。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞接種48 h后細(xì)胞生長(zhǎng)良好，與支架黏附緊密，增殖分裂正常。說(shuō)明絲素蛋白/殼聚糖三維支架材料具有良好的細(xì)胞相容性，可以作為軟骨組織工程研究種子細(xì)胞的載體。

林靜等[11]用鹽瀝濾法制備三維多孔絲素支架。在絲素多孔支架上培養(yǎng)人成骨肉瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及肝細(xì)胞。研究材料的細(xì)胞相容性，發(fā)現(xiàn)多種動(dòng)物細(xì)胞在鹽瀝濾法所制備的絲素多孔支架材料上能夠很好地黏附和增殖。并通過(guò)調(diào)整絲素水溶液的濃度、溶解絲素溶劑體系、NaCl添加量和NaCl粒徑，可以改變材料的力學(xué)性能、孔隙率、孔壁厚度等，制備出結(jié)構(gòu)和性質(zhì)可以調(diào)控的三維支架。

侯春春[12]以絲素蛋白溶液和自制碳酸鈣為原料，通過(guò)調(diào)節(jié)其共混質(zhì)量比、采用不同的制備方法，探索絲素蛋白/碳酸鈣復(fù)合支架的制備工藝，并對(duì)其理化性能和生物相容性進(jìn)行了相關(guān)測(cè)試。該試驗(yàn)中通過(guò)急性全身毒性試驗(yàn)、皮膚致敏試驗(yàn)、皮內(nèi)刺激試驗(yàn)、熱源試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、體外降解率測(cè)定等一系列試驗(yàn)證實(shí)，復(fù)合支架具有良好的生物相容性，具備發(fā)展成為優(yōu)越的骨組織工程材料的潛力。

Laura J.Bray等[13]制作的雙層絲素支架材料，并在材料上培養(yǎng)角膜緣上皮細(xì)胞（L-EC）和角膜緣間質(zhì)干細(xì)胞（L-MSC），比較觀察了兩種細(xì)胞在有孔和無(wú)孔材料上的生長(zhǎng)和表型。研究表明，兩種細(xì)胞在有孔材料和無(wú)孔材料上生長(zhǎng)表現(xiàn)出不同的形態(tài)。兩種細(xì)胞在雙層絲素支架材料上的生長(zhǎng)與單層絲素膜呈現(xiàn)相似的形態(tài)，該結(jié)果支持由絲素三維支架制備角膜緣的可行性。

Chinmoy Patra等[14]將一種印度柞蠶絲制備絲素蛋白支架用于體外的心臟修復(fù)。試驗(yàn)將三日齡小鼠心室心肌細(xì)胞接種于材料上，測(cè)試了細(xì)胞對(duì)材料的粘附性，細(xì)胞的代謝活性，細(xì)胞對(duì)外來(lái)刺激的反應(yīng)，細(xì)胞與細(xì)胞之間的信息傳遞以及細(xì)胞的收縮性。研究表明，絲素蛋白具有與纖連蛋白——心肌細(xì)胞基質(zhì)中的一種成分類似的特性。而且這種柞蠶絲蛋白含有RGD序列，呈現(xiàn)出比普通絲素更優(yōu)越的性能。因此，該材料有望用于心臟疾病的修復(fù)。

Tullia Maraldi等[15]研究了人羊水膜干細(xì)胞（AF?SCs）培養(yǎng)在不同多孔支架上時(shí)合成礦化細(xì)胞外基質(zhì)的潛力，多孔支架材料分別由膠原蛋白，外消旋聚乳酸和絲素蛋白制備。研究表明，三維的支架材料的應(yīng)用使AFSCs成骨細(xì)胞的分化能力和礦化細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)量都明顯高于二維材料。可見AFSCs具有在體內(nèi)產(chǎn)生三維礦化生物工程材料的巨大潛力，而且絲素蛋白可能是用來(lái)修復(fù)臨界骨缺損的有效支架材料。

3 結(jié)語(yǔ)

絲素蛋白作為一種天然的高分子材料，具有良好的生物相容性，降解性，可改良性和拉伸機(jī)械性能等。絲素蛋白是由天然氨基酸疏水段和親水段組成的嵌段復(fù)合物，疏水段可通過(guò)氫鍵和疏水基團(tuán)的相互作用形成β-平面或晶體，從而產(chǎn)生較高的力學(xué)強(qiáng)度，為絲素支架提供優(yōu)良的結(jié)構(gòu)相容性。而且，絲素蛋白作為一種良好的細(xì)胞生長(zhǎng)介質(zhì)，能夠很好地促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖，具有良好的細(xì)胞相容性。因此，絲素蛋白支架材料在組織工程領(lǐng)域具有很好的開發(fā)和應(yīng)用前景。

[1]曾戎，屠美.生物醫(yī)用仿生高分子材料[M].廣州：華南理工大學(xué)出版社，2010：127～132.

[2]Altman GH，Diaz F，Jakuba C，et al.Silk-based biomateri?als[J].Biomaterials.2003，24（3）：401～409.

[3]Donald Voet Judith QVoet.Biochemistry[M].New York：John Wiley&Sons，1990：87～101.

[4]劉洋，趙彬.牙周組織工程中殼聚糖—絲素蛋白—磷酸三鈣復(fù)合物應(yīng)用研究[J].中國(guó)實(shí)用口腔科雜志.2011，4（6）：345～347.

[5]鞠剛，徐衛(wèi)袁，張亞，等.多孔絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨缺損[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù).2011，15（29）：5327～5340.

[6]Sarmistha Talukdara，Quynhhoa T.Nguyen，Albert C.Chen，et al.Effect of initial cell seeding density on 3D-en?gineered silk f i broin scaffolds for articular cartilage tissue engineering[J].Biomaterials.2011，32（34）：8927～8937.

[7]Mengqing Zang，Qixu Zhang，Greg Davis，et al.Perichon?drium directed cartilage formation in silk f i broin and chi?tosan blend scaffolds for tracheal transplantation[J].Acta Biomaterialia.2011，7（9）：3422～3431.

[8]Nandana Bhardwaj，Subhas C.Kundu Silk f i broin protein and chitosan polyelectrolyte complex porous scaffolds for tissue engineering applications[J].Carbohydrate Poly?mers.2011，85（2）：324～333.

[9]Jiankang He，Yaxiong Liu，Xing Hao，et al.Bottom-up generation of 3D silk f i broin-gelatin microf l uidic scaf?folds with improvedstructural and biological properties[J].Materials Letters，2012，78（1）：102～105.

[10]佘榮峰，鄧江，黃文良，等.絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合支架材料的細(xì)胞相容性[J].中國(guó)組織工程研究，2012，3（16）：455～458.

[11]林靜，馬西蘭，曹傳寶.天然絲素制備三維多孔支架[J].北京理工大學(xué)學(xué)報(bào).2011，31（9）：1109～1113.

[12]侯春春.絲素蛋白/碳酸鈣復(fù)合支架材料的制備及其理化性能、生物相容性研究[D].重慶：西南大學(xué)研究生院，2011.

[13]Laura J.Bray，Karina A.George，Dietmar W.Hutmacher，et al.A dual-layer silk f i broin scaffold for reconstructing the human corneal limbus[J].Biomaterials.2012，33（13）：3529-3538.

[14]Chinmoy Patra，Sarmistha Talukdar，Tatyana Novoyatleva，et al.Silk protein f i broin from Antheraea mylitta for cardi?ac tissue engineering[J].Biomaterials.2012，33（9）：2673-2680.

[15]Tullia Maraldi，Massimo Riccio，Elisa Resca，et al.Hu?man Amniotic Fluid Stem Cells Seeded in Fibroin Scaf?fold Produce In Vivo Mineralized Matrix[J].Tissue Engi?neering.2011，17（21）：1-11.