郭從容 馬景學(xué) 張斌 崔月先

視網(wǎng)膜色素變性(RP)是一組以光感受器細(xì)胞和色素上皮細(xì)胞功能喪失為共同表現(xiàn)的遺傳性視網(wǎng)膜疾病。其主要表現(xiàn)為夜盲和進(jìn)行性視野損害，最終因光感受器細(xì)胞變性死亡而導(dǎo)致中心視力喪失［1］。RP是由一系列廣泛的惡性基因突變所引發(fā)的病變，截至目前，已被發(fā)現(xiàn)的相關(guān)突變超過(guò)192種之多［2］。從基因突變到光感受器細(xì)胞變性死亡的發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前在人類RP的某些類型中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了和rd小鼠相同的基因突變位點(diǎn)［3］。目前rd1小鼠作為研究RP的動(dòng)物模型已被廣泛應(yīng)用［4］。但因其發(fā)病早，進(jìn)展迅速，而并非理想的動(dòng)物模型。rd10小鼠生后18 d變性開(kāi)始，其發(fā)病晚進(jìn)展較緩慢作為研究常染色體隱性遺傳性視網(wǎng)膜色素變性的模型明顯優(yōu)于rd1小鼠［5］。我們對(duì)rd10小鼠自然病程中視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)和功能變化進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步的研究提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6(B6)和 B6.CXB1-Pde6brd10/J(rd10)小鼠均購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室。小鼠均在12 h光照(150 lux)/12 h黑暗循環(huán)下飼養(yǎng)。

1.2 視網(wǎng)膜電圖(ERG)檢查 B6和rd10小鼠18只，出生后17、25、32 d行ERG檢查。每組6只小鼠，檢查前暗適應(yīng)過(guò)夜。腹腔注射氯胺酮(50 mg/kg)和甲苯噻嗪(10 mg/kg)麻醉，用含0.4%托吡卡胺和0.5%苯福林鹽酸鹽的滴眼液充分散瞳。參照文獻(xiàn)［6］的方法，右眼行ERG檢查。記錄強(qiáng)度為30 cd-s/m2，3 ms閃光刺激產(chǎn)生的暗適應(yīng)ERG波形。之后用30 cd-s/m2光明適應(yīng)10 min后，記錄30 cd-s/m2閃光刺激下明適應(yīng)ERG波形。用SCOPE 3 Version 3.8.2軟件測(cè)量暗適應(yīng)ERG的a波和b波振幅及明適應(yīng)ERG最大波峰值用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 光學(xué)相干斷層成像(OCT)檢查 右眼ERG檢查后左眼行OCT檢查。使用Heidelberg公司的SD-OCT，以視乳頭為中心放射狀(12線)掃描，并通過(guò)其自帶的分析軟件測(cè)量距視乳頭中心2 000 μm的24點(diǎn)的全層視網(wǎng)膜厚度，取平均值用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 組織學(xué)檢查 OCT檢查后，斷頸處死動(dòng)物。立即摘出左眼球(每組6只眼球)，保留1～2 mm長(zhǎng)的視神經(jīng)，固定于4℃，4%多聚甲醛磷酸緩沖液中24 h。梯度乙醇脫水，石蠟包埋，平行于角膜頂點(diǎn)至視盤的水平位做4 μm厚切片，行蘇木精-伊紅染色。測(cè)量?jī)蓚?cè)距視乳頭500 μm處視網(wǎng)膜外顆粒層(ONL)厚度，計(jì)數(shù)兩側(cè)距視乳頭500～740 μm范圍內(nèi)ONL中細(xì)胞核的數(shù)量。取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OCT結(jié)果 用OCT檢查測(cè)量小鼠活體視網(wǎng)膜全層厚度。B6小鼠生后17 d時(shí)視網(wǎng)膜全層厚度已達(dá)(256±15)μm，且日齡增長(zhǎng)厚度無(wú)明顯變化。rd10小鼠生后17 d時(shí)視網(wǎng)膜全層厚度達(dá)(253±15)μm，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。但生后25 d時(shí)迅速減少到(166±6)μm，并隨日齡增長(zhǎng)繼續(xù)變薄，至生后32 d時(shí)，視網(wǎng)膜組織只有(148±4)μm厚。見(jiàn)圖1。

圖1 OCT圖形及結(jié)果分析

2.2 組織學(xué)分析 組織學(xué)結(jié)果顯示，B6小鼠生后17 d時(shí)ONL厚度已達(dá)(53.4±4.2)μm，且日齡增長(zhǎng)厚度無(wú)明顯變化。rd10小鼠生后17 d時(shí) ONL厚度達(dá)(53.0±6.0)μm，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。但生后25 d迅速減少到(23.7 ±4.0)μm，并隨日齡增長(zhǎng)繼續(xù)變薄，至生后 32 d 時(shí)，ONL只有(9.0±1.6)μm厚。ONL中細(xì)胞核的數(shù)量也是同樣變化規(guī)律。見(jiàn)圖2。

圖2 組織學(xué)分析

2.3 ERG結(jié)果 無(wú)論是暗適應(yīng)ERG還是明適應(yīng)ERG的振幅，rd10小鼠組都明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。暗適應(yīng)ERG a波，B6小鼠生后17 d時(shí)振幅已達(dá)(505±60)μV，并隨日齡增加略有加大。而rd10小鼠生后17 d時(shí)振幅只有(306±30)μV，并隨日齡增長(zhǎng)振幅進(jìn)一步降低。暗適應(yīng)ERG b波，B6小鼠生后17 d時(shí)振幅已達(dá)(798±68)μV，并隨日齡增加略有加大。而rd10小鼠生后17 d時(shí)振幅只有(422±48)μV，并隨日齡增長(zhǎng)振幅進(jìn)一步降低。至日齡32 d時(shí)暗適應(yīng)ERG幾乎接近于直線。明適應(yīng)ERG最大波峰值，B6小鼠生后17 d時(shí)振幅已達(dá)(128±16)μV，并隨日齡增加略有加大。而rd10小鼠生后17 d時(shí)振幅為(110±12)μV，并隨日齡增長(zhǎng)振幅進(jìn)一步降低，生后25 d為(70±9)μV，生后32 d為(40±8)μV。見(jiàn)圖3。

圖3 ERG圖形及結(jié)果分析

3 討論

OCT檢查是一種新的影像學(xué)檢查方法，具有非創(chuàng)傷性、非接觸性的優(yōu)點(diǎn)，并可進(jìn)行微米級(jí)的定量分析，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床。OCT檢查是一種活體檢查，可動(dòng)態(tài)觀察病變的變化，特別是某種治療方法療效的長(zhǎng)期觀察，可大大減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用量。

RP是遺傳性視覺(jué)損害和盲目的常見(jiàn)原因之一，世界各國(guó)的發(fā)病率為1/5 000～1/3 000，據(jù)估計(jì)全世界約150萬(wàn)人患此疾病［7］?；诨蛩降乃幬镏委熞约盎蛱娲煼ㄒ驯粡V泛研究。但隨著研究的深入，越來(lái)越多的相關(guān)突變基因被發(fā)現(xiàn)，這一事實(shí)要求對(duì)其的治療進(jìn)行更多的改進(jìn)。然而這些改進(jìn)都需要在動(dòng)物模型上進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試效果取決于所采用的模型，而這些模型發(fā)生病變的速度要么太快，要么又太慢。以被廣泛應(yīng)用的rd1小鼠模型為例，早在生后5～14 d，就產(chǎn)生了PDE6b基因突變的導(dǎo)致的嚴(yán)重后果，以至于視網(wǎng)膜在完全成熟之前，就已經(jīng)損失了多層光感受器細(xì)胞［8］。rd10小鼠生后17 d無(wú)論是視網(wǎng)膜全層厚度還是ONL厚度都達(dá)到正常對(duì)照小鼠的厚度。雖然視網(wǎng)膜功能方面未能達(dá)到正常水平，我們最近的研究顯示完全黑暗環(huán)境下飼養(yǎng)rd10小鼠，可以使視網(wǎng)膜變性開(kāi)始的時(shí)間延后和變性速度延緩。rd10小鼠的這種特性使得其更能模擬RP的發(fā)病過(guò)程。

我們的研究數(shù)據(jù)顯示，作為RP的動(dòng)物模型rd10小鼠明顯優(yōu)于rd1小鼠。特別是在早期治療的測(cè)試中rd10小鼠模型有更大的應(yīng)用價(jià)值。

1 Hartong DT，Berson EL，Dryja TP.Retinitis pigmentosa.Lancet，2006，368:1795-1809.

2 程亞穎，趙秀勉，宮麗芬.不同濃度大鼠吸氧對(duì)新生大鼠視網(wǎng)膜影響的研究.河北醫(yī)藥，2011，33:3698-3700.

3 Bowes C，Li T，Danciger M，et al.Retinal degeneration in the rd mouse is caused by a defect in the beta subunit of rod cGMP-phosphodiesterase.Nature，1990，347:677-680.

4 Punzo C，Cepko C.Cellular responses to photoreceptor death in the rd1 mouse model of retinal degeneration.Invest Ophthalmol Vis Sci，2007，48:849-857.

5 Chang B，Hawes NL，Pardue MT，et al.Two mouse retinal degenerations caused by missense mutations in the beta-subunit of rod cGMP phosphodiesterase gene.Vision Res，2007，47:624-633.

6 Takahashi M，Miyoshi H，Verma IM，et al.Rescue from photoreceptor degeneration in the rd mouse by human immunodeficiency virus vector-mediated gene transfer.J Virol，1999，73:7812-7816.

7 Yao J，Jia L，Khan N，Zheng QD，et al.Caspase inhibition with XIAP as an adjunct to AAV vector gene-replacement therapy:improving efficacy and prolonging the treatment window.PLoS One，2012，7:e37197.

8 Souied EH，Reid SN，Piri NI，et al.Non-invasive gene transfer by iontophoresis for therapy of an inherited retinal degeneration.Exp Eye Res，2008，87:168-175.