宋衛(wèi)紅，湯長發(fā)，劉文鋒

（1．湖南人文科技學院體育科學系，婁底417000；2．湖南師范大學體育學院，長沙410012）

細胞凋亡是細胞接受某種信號或受到某種因素刺激后，為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而發(fā)生的一種主動性消亡過程。它既出現(xiàn)在個體正常的發(fā)育過程中，也出現(xiàn)在非正常生理狀態(tài)或疾病中。研究人員應用電子顯微鏡、TUNEL、凝膠電泳DNA片斷檢測、流式細胞技術(shù)等方法，發(fā)現(xiàn)運動性心肌微損傷，運動性肝損傷、腎損傷，腦損傷，神經(jīng)組織損傷，內(nèi)分泌腺損傷等發(fā)生過程中都有細胞凋亡的參與，而且細胞凋亡程度與運動強度、運動量有關(guān)。細胞凋亡（apoptosis）在運動期間和之后的骨骼肌細胞損傷中也扮演著非常重要的作用。有研究證明骨骼肌細胞凋亡具有一定的時相性，蔡保塔等在研究不同運動強度與骨骼肌細胞凋亡的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)在運動訓練前3天，腓腸肌細胞凋亡明顯升高，與骨骼肌運動損傷主要臨床癥狀表現(xiàn)出延遲性肌肉酸痛發(fā)生時相相一致［1］。黃穎峰［2］等人在研究恒定負荷耐力訓練對大鼠骨骼肌細胞凋亡的影響時發(fā)現(xiàn)第1，2周周末運動后24 h時恢復組骨骼肌細胞凋亡率均大于運動后即刻組和運動后3 h組，提示運動導致的肌肉細胞凋亡有一定時相性和矛盾性，運動導致的細胞凋亡不是運動后即刻發(fā)生的，而是延遲性的。但 Podhorska-Okolow等［3］對運動后正常鼠的細胞凋亡情況進行時相研究時發(fā)現(xiàn)，鼠自發(fā)的在鼠輪中跑一晝12 h后誘發(fā)骨骼肌損傷，發(fā)現(xiàn)運動后即刻細胞凋亡比例較高，6 h后凋亡下降，而96 h后凋亡不足1%。離心運動是致骨骼肌微損傷的主要運動方式，離心運動對細胞凋亡的時序性影響如何，它是否與運動骨骼肌微損傷有一定的關(guān)聯(lián)，還需要更多的實驗來證明。

肌衛(wèi)星細胞是位于基膜與細胞膜之間的一群單核細胞，當肌肉損傷、壞死或負荷過重時，該細胞被激活，開始增殖、分化并融合成肌管，或遷移到受損的肌管處，最后形成新的肌纖維或修復受損的骨骼肌纖維。在超負荷或肌肉損傷后，肌衛(wèi)星細胞增殖形成新的肌核來保證骨骼肌細胞的生長和修復。細胞的發(fā)生、增殖、分化和死亡的過程是密不可分的。凋亡和增殖的相互平衡才能使細胞和組織保持穩(wěn)定。離心運動后不同恢復期的細胞凋亡和增殖在運動性骨骼肌微損傷和修復中扮演著重要角色。本實驗利用電子顯微鏡結(jié)合TUNNEL和PCNA免疫組織化學方法探討凋亡和增殖在運動性骨骼肌微損傷和修復中的作用。

1 材料與方法

1．1 實驗對象及分組

健康成年 8周齡雄性（SD）大鼠 50只，體重（212．55±15．74）g（購自湖南農(nóng)業(yè)大學動物中心，許可證號：湘scxk 2009-003），為清潔級實驗動物。以國家標準嚙齒類動物飼料分籠飼養(yǎng)，自由飲食和飲水。適應喂養(yǎng)三天后，進行一次5～10 min跑臺運動適應性訓練（速度為16 m／min，坡度為0°）。隨機分成對照組（C）和運動后即刻（B1）、運動后 3 h（B2）、運動后 24 h（B3）和運動后 48 h組（B4）（n＝10）。實驗期間室溫為 20℃～25℃，相對濕度為45%～55%，自然晝夜節(jié)律變化光照。

1．2 運動方案

運動組大鼠進行3 d的運動跑臺適應性訓練（速度為 16 m／min，坡度為-16°，時間為 5～10 min）后，休息兩天，正式開始實驗。進行重復三天力竭性離心運動，力竭模型采用跑臺運動，速度為16 m／min，坡度為-16°，持續(xù)運動至力竭。運動中采用電刺激或毛刷機械刺激鼠尾部，當動物出現(xiàn)臥位跑、反應遲鈍，“逃避反應”極差，短時間休息后（低于10 min）仍無法持續(xù)運動，則視為力竭。

1．3 標本制備

實驗運動方案結(jié)束后，在每組10只動物中隨機取2只右前肢肱三頭肌內(nèi)側(cè)頭下端0．5 mm×0．5 mm×0．2 mm標本放入2．5%戊二醛中固定，以備透射電鏡制備。迅速取右前肢肱三頭肌內(nèi)側(cè)頭下端肌腱和肌腹交界處取約1．0 mm×1．0 mm×0．2 mm標本放入4℃預冷的生理鹽水洗凈血液，濾紙吸干肌肉組織表面水分，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，4℃冰箱保存，進行常規(guī)石蠟包埋。

1．4 指標測試

1．4．1 骨骼肌細胞凋亡測定 采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記法（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）檢測凋亡細胞。嚴格按細胞凋亡檢測試劑盒（美國Promega公司）操作。在普通光學顯微鏡下觀察，陽性凋亡細胞表現(xiàn)為細胞核呈棕黃色或棕褐色著染。根據(jù)下列標準確定著色陽性細胞為凋亡細胞：（1）具有凋亡的核形態(tài)；（2）周圍或局部無炎癥反應。光學顯微鏡（×400）下每張切片隨機觀察6個視野，每個視野至少100個細胞核水平。以Simple PCI顯微圖像分析軟件測試每100個細胞中的平均陽性凋亡細胞數(shù)，即凋亡指數(shù)（Apoptosis Index，AI）。

1．4．2 PCNA的免疫組織化學測定 采用常規(guī)兩步免疫組化法，按試劑盒（美國Signet公司）說明書操作。以PBS代替一抗作陰性對照。結(jié)果判斷：成肌細胞的細胞增殖核抗原（proliferating cell nuclear antigen；PCDA）陽性染色模式為胞核著色，呈淺黃色至棕黃色顆粒。染色判斷標準：陰性不著色，弱陽性呈淡黃色，陽性呈黃色，強陽性呈棕黃色或棕色。陽（陰）性細胞計數(shù)方法：光鏡下，每張切片按對角線劃分區(qū)域選取5個視野，每個視野觀察100個細胞，統(tǒng)計出陽性細胞數(shù)，最后計算100個細胞中陽性細胞數(shù)，即增殖指數(shù)（Proliferation Index，PI）。

1．5 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示。統(tǒng)計分析使用SPSS 11．5統(tǒng)計分析軟件完成。各組之間，C、B1、B2、B3、B4采用單因素方差（one-way ANOVA）分析。

2 結(jié)果

2．1 大鼠骨骼肌細胞凋亡變化

2．1．1 計算機顯微圖像觀察 使用TUNEL法對骨骼肌細胞凋亡進行檢測，光鏡下觀察凋亡細胞核呈棕黃褐色為陽性細胞核，正常的細胞核呈藍色。對照組，可偶爾見到陽性的細胞核；運動后即刻組，可見到較多的棕黃色陽性凋亡核，凋亡核并不平均分布在每個肌細胞中，而是以肌束為區(qū)域分布。但是運動后3 h凋亡核卻減少了，運動后24 h組凋亡核最多，運動后48 h組凋亡核的數(shù)目有所減少。

2．1．2 顯微圖像分析結(jié)果 利用麥克奧迪圖像分析系統(tǒng)對凋亡率進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)運動后即刻細胞凋亡指數(shù)明顯高于對照組 （P＜0．01）；運動后3 h凋亡指數(shù)下降，與運動后即刻沒有顯著性差異（P＞0．05）；到運動后 24 h，凋亡指數(shù)升高，明顯高于運動后即刻和運動后3 h（P＜0．05）；運動后48 h凋亡指數(shù)比運動后24 h有所下降，但還是明顯高于對照組（P＜0．05，表 1）。

Tab．1 Apoptosis occurrence and index（AI）of skeletal muscle cell in different restoration stages（%，ˉx±s，n＝10）

2．1．3 透射電子顯微鏡觀察結(jié)果

在電鏡下觀察肌纖維的超微結(jié)構(gòu)，重點觀察細胞核及線粒體的變化，正常肌細胞核為長橢圓形，含有彌散的染色質(zhì)，其位置緊靠質(zhì)膜下，根據(jù)電鏡觀察到質(zhì)膜下細胞核出現(xiàn)獨特的凋亡特征，就可以確定為肌細胞核凋亡。凋亡肌細胞核呈現(xiàn)不規(guī)則的形狀，高度凝縮的染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象的空泡結(jié)構(gòu)，或沿核膜內(nèi)表面分布，凋亡細胞核所在的肌纖維膜完整，凋亡核附近未見明顯的肌原纖維損傷，但線粒體增殖，部分線粒體出現(xiàn)腫脹或空泡（圖 1）。

2．2 大鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖結(jié)果及分析

2．2．1 計算機顯微圖像觀察 光鏡下檢測PCNA蛋白表達陽性信號定位于細胞核，核著黃色或棕黃色。在運動后即刻組和運動后3 h組染色較深，呈棕黃色，但在運動后24 h和48 h染色較淺，呈淡黃色或淡棕色。以肌束為區(qū)域分布，有些肌束增殖較多，而另一些肌束內(nèi)增殖很少或沒有。

Fig．1 Electron micrographs of cell in skeletal muscle of rats C：Morphology and nuclei of normal skeletal muscle fiber was regular（×18．2K）；B1：Apoptotic cells nuclei appeared（×18．6K）；B2：Chromatic agglutination as crescentiformappeared（×36．4K）；B3：More apoptotic cells nuclei was observed（×30．3K）；B4：Nuclear cracks was observed（×36．4K）

2．2．2 顯微圖像系統(tǒng)分析結(jié)果 對照組出現(xiàn)少量的黃色增殖核。增殖指數(shù)僅為11．860%±2．996%。運動后肌衛(wèi)星細胞增殖指數(shù)明顯高于對照組，運動后即刻，增殖指數(shù)為40．840%±7．961%，與對照組具有顯著性差異（P＜0．05）；運動后 3 h，肌衛(wèi)星細胞的增殖指數(shù)下降，與運動后即刻組差異顯著（P＜0．05）；運動后 24 h達到最高值，增殖指數(shù)為46．127%±8．899%，與對照組具有顯著性差異（P＜0．05），與運動后 3 h也有顯著差異（P＜0．05），但是與運動后即刻沒有顯著性差異（P＞0．05），表明此時肌衛(wèi)星細胞增殖最多；到運動后48 h，肌衛(wèi)星細胞的增殖肌衛(wèi)星細胞的增殖指數(shù)比運動后24 h減少（P＜0．05），但還未恢復到對照組（P＜0．05，表 2）。

Tab．2 Proliferation index（pI）of skeletal muscle cell in different restoration stages（%，ˉx±s，n＝10）

Fig．2 Diagram of correlation between AI and PIAI：Cell Apoptosis apoptosis index；PI：Proliferation index

2．3 細胞凋亡指數(shù)與增殖指數(shù)的相關(guān)性分析

利用簡單相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖指數(shù)與骨骼肌細胞凋亡指數(shù)呈中度正相關(guān)（P＜0．05）。說明離心運動后凋亡與增殖存在一定的關(guān)系。

3 討論

3．1 離心運動對骨骼肌細胞凋亡的影響

凋亡作為程序性死亡的一種特殊方式在生長、發(fā)育調(diào)節(jié)和疾病中發(fā)揮著重要角色。很多證據(jù)表明細胞凋亡在骨骼肌細胞損傷的病理生理中扮演著重要的角色。骨骼肌細胞凋亡存在于肌肉萎縮、慢性心肌疾病的骨骼肌中、骨骼肌失神經(jīng)、骨骼肌失重、退用以及急性運動中。在運動過程中和運動后，骨骼肌和心肌的自發(fā)性凋亡是短期或長期的運動性骨骼肌損傷一個特殊致病原因。

ARSLAN［4］等人經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn) Wistar大鼠在經(jīng)過輪內(nèi)自發(fā)跑運動后，利用TUNEL法測量凋亡指數(shù)，運動后即刻比目魚肌細胞凋亡核顯著上升，由安靜時的 0．98×10-3±1．83×10-3上升到 3．03×10-3±2．78×10-3，運動后 24 h凋亡核上升到 4．48×10-3±3．32×10-3。Boffi［5］等對純種馬進行了三個月的跑臺訓練，在肌肉活檢中，發(fā)現(xiàn)運動訓練組的肌細胞凋亡顯著性高于控制組（P＜0．01），并推測正是新生的更具生命力的細胞不斷代替凋亡的異常肌細胞這一過程，是訓練導致體能增長的機制。我國學者通過實驗發(fā)現(xiàn)運動訓練后大鼠骨骼肌細胞凋亡明顯增加，1周后達到高峰，2周、3周后下降［6］。王長青等對大鼠進行了為期1 d、6 d、12 d和18 d的運動訓練，運動訓練結(jié)束后40 min取材，用流式細胞技術(shù)和TUNEL法檢測骨骼肌細胞的凋亡情況，研究發(fā)現(xiàn)對照組骨骼肌組織中有自發(fā)性細胞凋亡發(fā)生，但百分比很低，而運動訓練可使骨骼肌細胞凋亡的比例增加，其中以訓練6 d組骨骼肌細胞凋亡的比例最高［7］。本實驗結(jié)果表明，大鼠在經(jīng)過3 d重復性力竭運動后，骨骼肌細胞核發(fā)生了凋亡，其凋亡指數(shù)在運動后即刻明顯升高，運動后24 h達到峰值，運動后48 h凋亡指數(shù)有所下降，與對照組有顯著的差異。也就是說細胞凋亡出現(xiàn)了明顯的時序性，而且與運動性骨骼肌微損傷的時序性一致。那么這種結(jié)果出現(xiàn)的原因是什么呢？綜合前人的研究成果，分析如下：

離心運動致骨骼肌細胞凋亡時序性變化的可能機制為：（1）離心運動導致胞漿內(nèi)Ca2＋濃度升高，引起中性蛋白酶活性增強使結(jié)構(gòu)破壞而形成骨骼肌損傷。而胞漿內(nèi)鈣濃度大幅度增加引發(fā)細胞一系列生理、生化反應，如通過激活蛋白酶，如鈣蛋白酶、核支架蛋白酶、死亡相關(guān)蛋白激酶等，谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，凋亡相關(guān)基因，以及核酶（包括內(nèi)切酶、拓撲異構(gòu)酶）等從而介導細胞凋亡。（2）胞漿內(nèi)Ca2＋濃度升高使線粒體Ca2＋超載導致線粒體膜通道的改變、自由基的釋放、線粒體膜電位的下降及細胞色素C的釋放，抑制ATP的生成，進而抑制氧化磷酸化，從而引起細胞凋亡。（3）由于離心運動導致肌漿網(wǎng)釋放出大量的鈣，以及肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2＋轉(zhuǎn)運能力下降，包括鈣釋放通道鈣釋放能力和鈣泵逆濃度梯度攝鈣能力都下降，所以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的鈣得不到及時的補充而減少，從而導致細胞凋亡。（4）離心運動使機體產(chǎn)生的自由基不僅通過脂質(zhì)過氧化損傷細胞膜和內(nèi)膜系統(tǒng)，造成細胞凋亡，同時使蛋白質(zhì)和酶分子失活，損傷線粒體DNA，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達等誘導細胞凋亡。（5）HSP與細胞凋亡關(guān)系密切，尤其HSP70、HSP27對熱休克、氧化應激、電離輻射、FNF-α等引起的細胞凋亡有保護作用，可抑制誘導的蛋白激酶激活、抑制凋亡基因P53和Bax的表達、抑制凋亡信號轉(zhuǎn)導中的蛋白水解酶和抑制氧自由基生成以及對細胞線粒體功能的保護作用有關(guān)，運動后即刻，HSP27很強的表達［8］，抑制了細胞凋亡。隨著時間的延長，HSP27的表達逐漸減少，細胞凋亡加劇。

3．2 離心運動對大鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖的影響

肌衛(wèi)星細胞是位于基膜與細胞膜之間的一群單核細胞，緊貼于肌細胞表面，胞核扁圓。在正常狀態(tài)下處于靜止期，當肌肉損傷、壞死或負荷過重時，該細胞被激活，開始增殖（有絲分裂）、分化（功能蛋白的表達）并融合成肌管，或遷移到受損的肌管處，最后形成新的肌纖維或修復受損的骨骼肌纖維。結(jié)果是產(chǎn)生新的肌細胞核保持細胞核的穩(wěn)態(tài)，或使骨骼肌肥大或修復被損的肌纖維或聚集成肌管形成新的肌纖維。目前的研究認為肌衛(wèi)星細胞增殖一般在運動后24 h到7 d之內(nèi)。

本實驗利用免疫組織化學方法測量PCNA的表達，結(jié)果是肌衛(wèi)星細胞的增殖運動后即刻和運動后24 h兩個高峰期。運動后即刻肌衛(wèi)星細胞增殖指數(shù)明顯高于對照組，同時電鏡發(fā)現(xiàn)運動后即刻出現(xiàn)了成肌細胞與骨骼肌融合現(xiàn)象；運動后3 h，肌衛(wèi)星細胞的增殖指數(shù)反而下降；運動后24 h肌衛(wèi)星細胞增殖最多；到運動后48 h，肌衛(wèi)星細胞的增殖減少，但還未恢復到對照組。

此次運動是重復三天力竭性離心運動，運動后即刻衛(wèi)星細胞增殖較多，而且電鏡發(fā)現(xiàn)運動后即刻肌衛(wèi)星細胞增殖的同時出現(xiàn)了成肌細胞，原因有二：一是前兩天的離心運動導致肌衛(wèi)星細胞已經(jīng)增殖；二是成肌細胞有兩類前體細胞［9］，一般意義的肌衛(wèi)星細胞和執(zhí)行衛(wèi)星細胞，一般意義的衛(wèi)星細胞處于靜止狀態(tài)，受刺激后激活、增殖、分裂后一個子細胞作為成肌細胞，另一個子細胞保留下來作干細胞；執(zhí)行衛(wèi)星細胞的特點是在特殊情況下可以不經(jīng)有絲分裂，直接分化成成肌細胞。運動后即刻執(zhí)行衛(wèi)星細胞很快分化，所以運動后即刻衛(wèi)星細胞增殖增多。但是在運動后3 h，肌衛(wèi)星細胞增殖數(shù)量反而下降，可能是前兩次運動激發(fā)的肌衛(wèi)星細胞增殖已經(jīng)開始下降，而第三次運動激發(fā)的衛(wèi)星細胞增殖還未達到高峰。

3．3 骨骼肌細胞凋亡與增殖的相關(guān)性分析

肌衛(wèi)星細胞增殖與骨骼肌細胞凋亡呈正相關(guān)，說明凋亡與增殖存在一定的關(guān)系。細胞凋亡后，巨噬細胞增加。有人把從大鼠無菌性腹膜炎經(jīng)腹腔灌洗而獲得的含大量巨噬細胞的腹腔滲出液加入大鼠成肌細胞原代培養(yǎng)物中，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞與成肌細胞混合培養(yǎng)能明顯提高成肌細胞有絲分裂及分化融合形成肌小管的能力。說明巨噬細胞能分泌一種選擇性因子刺激成肌源性細胞增殖、分化，啟動再生形成肌纖維的過程［10］。骨骼肌細胞凋亡可能是啟動肌衛(wèi)星細胞增殖的因素，凋亡細胞的增多，導致巨噬細胞活性增強，巨噬細胞分泌選擇性因子，刺激成肌源性細胞分裂，導致細胞增殖。但是其過程及機制如何還有待進一步研究。

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