張國(guó)霞，周愛(ài)玲，張貴萍，胡亞娥，茅家慧

（南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，江蘇南通226001）

近幾年的臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證據(jù)說(shuō)明了腦內(nèi)神經(jīng)炎癥與多種急慢性神經(jīng)退行性疾病如帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）、阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）和多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）等的發(fā)生和發(fā)展有密切聯(lián)系［1，2］。

神經(jīng)炎癥反應(yīng)的一個(gè)很重要特征是腦內(nèi)固有免疫細(xì)胞尤其是小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。持續(xù)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活會(huì)通過(guò)釋放過(guò)量神經(jīng)毒性的炎癥因子如一氧化氮（nitric oxide，NO）、前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）、腫瘤壞死因子 （tumor necrosis factor，TNF）、白介素 6（interleukin-6，IL-6）及白介素 1β（in-terleukin-1β，IL-1β）引起神經(jīng)損傷［3，4］。

Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）作為脂多糖 （lipopolysaccharides，LPS）受體在先天免疫中所起的作用最重要。有研究表明AD腦中TLR4表達(dá)增多。那么，海馬這一與AD密切相關(guān)的組織中——海馬神經(jīng)元能否發(fā)生炎癥反應(yīng)呢？我們的實(shí)驗(yàn)首先研究海馬神經(jīng)元是否有TLR4介導(dǎo)的MyD88依賴途徑。在一般炎癥細(xì)胞中［5，6］，TLR4活化后與MyD88結(jié)合，依次激活下游信號(hào)分子IL-1受體相關(guān)激酶（IL-1 receptor associated kinase，IRAK）、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TNF-αreceptor associated factor 6，TRAF6）；然后，TRAF6激活 NF-κB信號(hào)通路［7］：NF-κB一般是由p65和p50亞單位組成的異源二聚體。在未激活狀態(tài)下，NF-κB與抑制蛋白IκB結(jié)合以無(wú)活性的形式存在于胞漿。LPS激活TLR4后解除IκB對(duì) NF-κB的抑制作用、促進(jìn) NF-κB核易位、激發(fā)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)IL-1、TNF-α等合成和釋放。

本研究采用原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元作為研究對(duì)象，用TLR4配體LPS或TLR4抗體預(yù)處理海馬神經(jīng)元，以激活或阻斷TLR4的作用，運(yùn)用RT-qPCR、免疫熒光及Western blot等技術(shù)，探討海馬神經(jīng)元是否有TLR4介導(dǎo)的的MyD88依賴途徑及該途徑的激活或阻斷后對(duì)炎癥介質(zhì)生成的影響。通過(guò)研究，期望在理論上為海馬神經(jīng)元TLR4介導(dǎo)的MyD88依賴途徑在神經(jīng)炎癥方面的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 動(dòng)物 出生1 d內(nèi) SPF級(jí) SD大鼠，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1．1．2 試劑與儀器 DMEM／F12培養(yǎng)基和 B27添加劑（Invitrogen），胎牛血清（杭州四季青），多聚賴氨酸、脂多糖、阿糖胞苷、胰蛋白酶（Sigma）。Trizol（Invitrogen）、SYBR Green Master（Rox）（Roche），TLR4 antibody、β-actin antibodies（SANTA CRUZ），MyD88 antibody（CST），TRAF6 antibody（Epitomics），ECL（Millipore），ELISA試劑盒（R＆B）。

1．2 原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)及純度鑒定

無(wú)菌操作下取新生1 d內(nèi)SD乳鼠海馬回，放入冰D-Hank’s，在解剖顯微鏡下剔除腦膜和血管，剪碎組織成約1 mm3，37℃下0．125%胰蛋白酶消化20 min并以巴斯德管吹打數(shù)次，用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化，經(jīng)孔徑為75μm的尼龍網(wǎng)過(guò)濾，離心，棄上清，用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基吹散細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以1×106cells／well種植于多聚賴氨酸包被的六孔板中，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)（37℃，5%CO2），24 h后全量換液，72 h后加阿糖胞苷，以后每3天換液一次。培養(yǎng)7 d后采用神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）和Hoechst的細(xì)胞免疫熒光雙標(biāo)方法，對(duì)培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元進(jìn)行純度的鑒定。

1．3 細(xì)胞處理

將 LPS按儲(chǔ)存濃度（1 mg／ml）溶于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，避光存于-20℃，用時(shí)基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋至終濃度10μg／ml，以不同時(shí)間點(diǎn)作用于海馬神經(jīng)元。

1．4 免疫熒光檢測(cè)NF-κB核易位

將海馬神經(jīng)元以10 000 cells／well每孔的密度種植于放置圓玻片的24孔板內(nèi)，培養(yǎng)7 d后加入TLR4抗體培養(yǎng)，2 h后加入脂多糖處理。將圓玻片放入PBS中清洗，然后放入4%多聚甲醛室溫下固定30 min，PBS清洗三次，每次五分鐘，室溫下10%山羊血清封閉1 h，甩干后加入兔抗大鼠一抗（NF-κB antibody），37℃，60 min，后 4℃過(guò)夜。PBS清洗 3遍后加入羊抗兔熒光二抗室溫下避光孵育1 h，甩干后加1%Hochest染核15 min，用超純水沖洗，加防熒光淬滅劑，倒置顯微鏡下觀察，拍片。

1．5 Real-time PCR檢測(cè)不同處理組中MyD88和TRAF6的mRNA的表達(dá)。

提取各組細(xì)胞中的RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照以下參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，預(yù)變性95℃10 min，變性 95℃ 15 s，退火 60℃ 30 s，延伸 72℃ 30 s，40次循環(huán)后再延伸 72℃ 5 min，β-actin作為內(nèi)參。所用引物序列如下：MyD88基因擴(kuò)增序列上游引物5′GTGGTGGTTGTTTCTGACGAT 3′，下 游 引 物 5′CGCAGATAGTGATGAACCGTAG3′TRAF6上游引物5′CATTGTGAATTCGCTCTAGTGA3′， 下 游 引 物 5′GGACAGCTTTGATCGTGGA3′，β-actin上 游 引 物 5′CAGGTCATCACTATCGGCAAT 3′，下游引物 5′AGGTCTTTACGGATGTCAACG 3′。

1．6 Western blot檢測(cè)不同處理組中 MyD88和TRAF6蛋白的表達(dá)。

將六孔板中處理好的各組細(xì)胞棄培養(yǎng)基，用PBS輕洗，加入蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑PMSF，使PMSF的終濃度為1 mmol／L。充分裂解后，將混合液在4℃14 000 r／min離心15 min，取上清測(cè)總蛋白濃度。調(diào)整各組總蛋白濃度相等（20μg），用10%PAGE膠電泳分離，再轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h，后加一抗4℃過(guò)夜。TBST洗三次，加二抗室溫1 h，加ECL顯影。

1．7 ELISA檢測(cè)上清中各炎癥因子水平變化

將培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元分正常對(duì)照組、LPS刺激組、TLR4抗體阻斷加LPS刺激組，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，按ELISA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在酶標(biāo)儀450μm處讀取A值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β和 NO蛋白含量。。

1．8 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，用軟件 SPSS17．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2．1 LPS對(duì)海馬神經(jīng)元MyD88和TRAF6的表達(dá)影響

2．1．1 RT-qPCR 結(jié)果顯示，正常對(duì)照組海馬神經(jīng)元中MyD88和TRAF6 mRNA表達(dá)相對(duì)較少，LPS刺激4～12 h時(shí)，MyD88和TRAF6 mRNA的表達(dá)增加，與正常對(duì)照組比較，有非常顯著的差異（P＜0．01），但到24 h時(shí)與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0．05，圖 1）。

Fig．1 Effect of LPSon MyD88 and TRAF6 mRNA of hippocampal nuerons**P＜0．01 vs normal group

2．1．2 Western Blot結(jié)果可見(jiàn)，在正常對(duì)照組海馬神經(jīng)元中，MyD88和TRAF6蛋白表達(dá)相對(duì)較少，LPS刺激后，其蛋白水平表達(dá)增加。與正常對(duì)照組相比，在LPS刺激不同時(shí)間點(diǎn)后，MyD88和TRAF6蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，有顯著或非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05，P＜0．01，圖 2）。

Fig．2 Effects of LPSon MyD88 and TRAF6 protein of hippocampal nuerons MyD88：Myeloid differentiation facfor 88；TRAF6：TNF-αreceptor assoiated factor 6*P＜0．05，**P＜0．01 vs normal group

2．2 TLR4抗體預(yù)處理并LPS刺激的海馬神經(jīng)元MyD88和TRAF6的表達(dá)變化

2．2．1 RT-qPCR 結(jié)果顯示，正常對(duì)照組海馬神經(jīng)元中MyD88和TRAF6 mRNA表達(dá)相對(duì)較少；LPS單一刺激組：經(jīng) LPS刺激后，海馬神經(jīng)元 MyD88和TRAF6 mRNA明顯高于正常對(duì)照組（P＜0．01）；TLR4抗體阻斷聯(lián)合LPS剌激組：給以TLR4抗體預(yù)處理后，再給以與 LPS單一刺激組相同濃度的 LPS刺激海馬神經(jīng)元后，其MyD88和TRAF6 mRNA的表達(dá)明顯低于 LPS單一刺激組（P＜0．05，圖3）。

Fig．3 Effect of anti-TLR4 on MyD88 and TRAF6 mRNA in LPS-activated hippocampal nuerons MyD88：Myeloid differentiation facfor 88；TRAF6：TNF-αreceptor assoiated factor 6；LPS：Lipopolysaccharides；TLR4：Toll-like receptor 4**P＜0．01 vs normal group；＃P＜0．05 vs LPSgroup

2．2．2 Western blot結(jié)果可見(jiàn)，正常對(duì)照組海馬神經(jīng)元中MyD88和TRAF6蛋白表達(dá)相對(duì)較少；LPS刺激后的海馬神經(jīng)元，MyD88和TRAF6蛋白表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組（P＜0．01）；TLR4抗體阻斷聯(lián)合LPS剌激組：給以TLR4抗體預(yù)處理后，再給以與LPS單一刺激組相同濃度的 LPS刺激海馬神經(jīng)元后，其MyD88和TRAF6蛋白的表達(dá)明顯低于LPS單一刺激組 （P＜0．05，P＜0．01，圖 4）。

Fig．4 Effects of anti-TLR4 on MyD88 and TRAF6 protein expression in LPS-activated hippocampal nuerons MyD88：Myeloid differentiation facfor 88；TRAF6：TNF-αreceptor assoiated factor 6；LPS：Lipopolysaccharides；TLR4：Toll-like receptor 4*P＜0．05，**P＜0．01 vs normal group；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01 vs LPSgroup

2．3 免疫熒光技術(shù)檢測(cè)海馬神經(jīng)元NF-κB／P65核易位變化

免疫熒光結(jié)果顯示，在正常對(duì)照組海馬神經(jīng)元中，NF-κB／P65主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)（圖 5 A～C）；LPS刺激后，大多數(shù) NF-κB／P65易位到胞核（圖5 E～F）；而如果用LTR4抗體預(yù)處理培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元2h以后，再給以同樣濃度的LPS刺激，而LPS引起的NF-κB／P65核易位作用明顯減弱（圖5 G-I）。

Fig．5 Nuclear translocation of NF-κB／P65 of hippocampal nuerons in rats（Immunofluorescence×200）

2．4 ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中各炎癥因子水平

2．4．1 LPS對(duì)海馬神經(jīng)元培養(yǎng)上清中 TNF-α、IL-1β和NO的影響 為了探討LPS對(duì)海馬神經(jīng)元炎癥性細(xì)胞因子產(chǎn)生、釋放的影響，分別于 LPS刺激后 2、4、8、12、24 h收集培養(yǎng)上清液，ELISA法測(cè)定培養(yǎng)上清中 TNF-α、IL-1β和NO的濃度。與正常對(duì)照組相比，在 LPS刺激不同時(shí)間點(diǎn)后，其上清中 TNF-α、IL-1β和NO的濃度明顯上調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＜0．05，P＜0．01，圖 6）。

Fig．6 Effects of LPSon TNF-α，IL-1βand NO in culture supernatant LPS：Lipopoly saccharides；TNF-α：Tumor necrosis factor-α；IF-1β：Interleukin-1β；NO：Nitric oxide*P＜0．05，**P＜0．01 vs normal group

2．4．2 ELISA測(cè)定TLR4抗體預(yù)處理后LPS對(duì)海馬神經(jīng)元培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β和 NO的影響 結(jié)果可見(jiàn)，正常對(duì)照組培養(yǎng)上清中炎癥因子TNF-α、IL-1β和 NO釋放量較少。與正常對(duì)照組相比，LPS單一刺激組TNF-α、IL-1β和 NO釋放明顯增多（P＜0．01）。預(yù)先用TLR4抗體阻斷則明顯減弱了由LPS作用而引起的 TNF-α、IL-1β和 NO的釋放（P＜0．05，P＜0．01，圖 7）。

Fig．7 Effects of anti-TLR4 on production of TNF-α，IL-1βand NO in LPS-activated hippocampal nuerons in culture supernatant TLR4：Toll-like receptor 4；TNF-α：Tumor necrosis factor-α；IF-1β：Interleukin-1β；NO：Nitric oxide*P＜0．05，**P＜0．01 vs normal group；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01 vs LPSgroup

3 討論

TLR4是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)TLR相關(guān)蛋白，一種模式識(shí)別受體，主要識(shí)別革蘭陰性菌細(xì)胞壁成分LPS，本實(shí)驗(yàn)采用TLR4和Hoechst的雙重免疫熒光標(biāo)記，鑒定TLR4在海馬神經(jīng)元的定位情況。結(jié)果表明，TLR4是一跨膜受體，定位于海馬神經(jīng)元的胞膜

［5］。

MyD88是TLR4信號(hào)通路中的一個(gè)關(guān)鍵接頭分子，在傳遞上游信息和疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。在抵抗病原體入侵的免疫應(yīng)答啟動(dòng)過(guò)程中TLR4介導(dǎo)的MyD88信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能調(diào)節(jié)多種炎癥相關(guān)基因的表達(dá)［8］。

本實(shí)驗(yàn)采用RT-qPCR、Western blot法觀察海馬神經(jīng)元中 MyD88 mRNA、蛋白的表達(dá)。LPS激活TLR4實(shí)驗(yàn)，結(jié)果可見(jiàn)：正常對(duì)照組海馬神經(jīng)元中，MyD88 mRNA和蛋白的表達(dá)相對(duì)較少，LPS刺激后，MyD88 mRNA和蛋白水平明顯高于正常對(duì)照組（P＜0．05，P＜0．01）。TLR4抗體阻斷實(shí)驗(yàn)，結(jié)果可見(jiàn)：給以TLR4抗體預(yù)處理后，再給以與LPS單一刺激組相同濃度的LPS刺激，海馬神經(jīng)元MyD88 mRNA、蛋白的表達(dá)明顯低于 LPS單一刺激組（P＜0．05）。結(jié)果提示：通過(guò)刺激海馬神經(jīng)元TLR4能促進(jìn)MyD88的表達(dá)。

腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（tumor necrosis factor receptor associated factors，TRAFs）是腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族和 Toll樣／白細(xì)胞介素-1受體（Tool／IL-1 receptor，TIR）超家族重要的接頭分子。在MyD88依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，TRAF6是必需的連接分子［9］。

本實(shí)驗(yàn)采用RT-qPCR、Western blot法觀察海馬神經(jīng)元中 TRAF6 mRNA、蛋白的表達(dá)。結(jié)果可見(jiàn)：LPS激活海馬神經(jīng)元TLR4后，正常對(duì)照組海馬神經(jīng)元中，TRAF6 mRNA和蛋白的表達(dá)相對(duì)較少，LPS刺激后，TRAF6 mRNA和蛋白水平明顯高于正常對(duì)照組，（P＜0．05，P＜0．01）。TLR4抗體阻斷實(shí)驗(yàn)，結(jié)果可見(jiàn)：給以TLR4抗體預(yù)處理后，再給以與LPS單一刺激組相同濃度的LPS刺激，海馬神經(jīng)元TRAF6 mRNA、蛋白的表達(dá)明顯低于LPS單一刺激組（P＜0．05）。結(jié)果提示：LPS通過(guò)激活 TLR4，增加海馬神經(jīng)元中TRAF6的表達(dá)。

NF-κB是TLR4的下游分子之一，一般是由p65和p50亞單位組成的異源二聚體。在未激活狀態(tài)下，NF-κB與抑制蛋白IκB結(jié)合以無(wú)活性的形式存在于胞漿。有研究表明，在小膠質(zhì)細(xì)胞中，LPS激活TLR4后解除 IκB對(duì) NF-κB的抑制作用、促進(jìn) NF-κB核易位、激發(fā)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)IL-1、TNF-α等合成和釋放［7］。

本實(shí)驗(yàn)采用LPS刺激海馬神經(jīng)元，利用免疫熒光技術(shù)觀察NF-κB／p65核易位現(xiàn)象，在正常對(duì)照組海馬神經(jīng)元中，NF-κB／p65主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，LPS刺激后，易位到細(xì)胞核；而如果用 TLR4抗體預(yù)處理海馬神經(jīng)元后，再以同樣劑量的 LPS刺激，則 LPS引起的 NF-κB／p65核易位作用明顯減弱。NF-κB／p65的核異位是 NF-κB活化的標(biāo)志。結(jié)果提示，LPS能活化海馬神經(jīng)元 NF-κB，其發(fā)揮作用主要是通過(guò)核的易位來(lái)實(shí)現(xiàn)。

現(xiàn)有大量證據(jù)說(shuō)明激活的免疫細(xì)胞可產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)如TNF-a、IL-1β和NO等，它們能導(dǎo)致腦內(nèi)神經(jīng)元的變性死亡，尤其是致炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β在神經(jīng)退行性疾病中的作用受到廣泛關(guān)注

［10］。

本實(shí)驗(yàn)采用 ELISA方法測(cè)定 LPS刺激海馬神經(jīng)元不同時(shí)間后培養(yǎng)上清中 TNF-α、IL-1β和NO的濃度。結(jié)果顯示，LPS刺激后，海馬神經(jīng)元培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β和 NO濃度逐漸升高，與正常組相比，LPS刺激 2、4、8、12、24 h組海馬神經(jīng)元培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β和NO的濃度均顯著或非常顯著高于正常對(duì)照組（P＜0．05，P＜0．01）。預(yù)先用 TLR4抗體處理海馬神經(jīng)元4 h后，再給予同樣劑量的LPS刺激，TNF-α、IL-1β和NO濃度顯著低于單用 LPS刺激組（P＜0．05）。結(jié)果提示，LPS可以通過(guò)刺激海馬神經(jīng)元 TLR4，增加 TNF-α、IL-1β和 NO的分泌，增強(qiáng)腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

由此可見(jiàn)，海馬神經(jīng)元上有 TLR4的介導(dǎo)的MyD88依賴途徑，該途徑的激活參與了神經(jīng)炎癥反應(yīng)。通過(guò)上述研究，期望在理論上為海馬神經(jīng)元TLR4及其信號(hào)通路在神經(jīng)炎癥方面提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為神經(jīng)炎癥炎癥學(xué)說(shuō)增加新的知識(shí)。

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