李 鐳，梁智星，梁法禹

缺血預處理（ischemic preconditioning，IP）已經(jīng)在動物試驗中得到驗證［1］，但臨床實踐中很難充分應用。異氟烷作為常用的全身麻醉藥已經(jīng)在臨床上得到普遍應用。本文就異氟烷預處理后心肌功能的變化進行探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器和動物 異氟烷（isoflurane）：山東科源制藥有限公司（山東省醫(yī)藥工業(yè)研究所制藥廠）；肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒：長春匯力生物技術有限公司生產(chǎn)；K-H緩沖液（Krebs-Henseleit buffer solution，KHB）、心臟保存液為HTK液：北京榮生醫(yī)藥科技發(fā)展中心；SD大鼠由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 離體大鼠心臟模型的建立 成年SD大鼠36只，雌雄各半，體重270 g～320 g（6周齡～8周齡），腹腔注射肝素（3 mg／kg）和戊巴比妥鈉（65 mg／kg），仰臥位，開胸，于升主動脈和頭臂干近端切斷主動脈和上腔靜脈，切斷下腔靜脈，肺動脈分叉前切斷肺動脈，取出心臟，迅速放入0℃～4℃K-H緩沖液中，沖洗出心臟內殘留血液，并移至Langendorff灌注裝置上，經(jīng)主動脈灌注K-H液，根據(jù)大鼠正常生理血壓范圍，設定灌注壓為80 mm Hg～100 mm Hg，灌注液溫度維持35℃～37℃，鼠心周圍溫度在34℃～36℃。整個灌注期間用95%O2和5%CO2混合氣體飽和K-H液。肺動脈根部切開，充分引流冠狀靜脈回流液。經(jīng)預實驗掌握切取技術后，正式實驗時開胸取心至灌注開始控制在1 min內完成。穩(wěn)定3 min～5 min后切開心耳，經(jīng)左心房、二尖瓣，將連接測壓導管的球囊送入左心室，測壓導管的另一端連接多導生理記錄儀。向心室球囊內緩慢注射適量生理鹽水（55μL～70μL），使左室舒張末壓維持在10 mmHg～12 mm-Hg。平衡20 min后，心臟搏動達到穩(wěn)定狀態(tài)，測定血流動力學基礎值并留取冠脈流出液標本。

1.2.2 灌注及低溫保存方法（HTK保存液） 連續(xù)灌注K-H液平衡30 min后，經(jīng)主動脈根部單次灌注4℃的HTK液，灌注劑量為30 m L／kg，灌注時間為2 min，心臟表面同時降溫，心臟停搏后置于HTK液中保存。在4℃條件下分組保存4 h、6 h和8 h，保存期間不進行重復灌注。保存結束后重新將鼠心移至Langendorff裝置上灌注K-H液，逐漸復溫至37℃，使心臟復跳，并持續(xù)灌注30 min，測定血流動力學指標并留取冠脈流出液測量心肌酶。

1.3 選擇心臟的標準 離體心臟經(jīng)Langendorff裝置平衡灌注15 min后，心率（HR）＜200次／min，左室收縮壓（LVSP）＜75 mm Hg，早搏＞2次／min，舍棄不用。4 h組、6 h組中共有3只大鼠退出實驗，后續(xù)試驗補齊實驗例數(shù)。

1.4 實驗分組 采用完全隨機分組，根據(jù)造模前是否使用異氟烷預處理，將36只大鼠分為兩組，每組18只。實驗組：造模前2 d，每天腹腔注射異氟烷原液3 m L／kg。對照組：造模前2 d，每天腹腔注射生理鹽水3 m L／kg。之后再根據(jù)保存時間，各分為4 h組、6 h組、8 h組，每組6只。保存后6 h組1只大鼠，8 h組2只大鼠離體心不復跳，退出實驗，后續(xù)補齊例數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（x±s）表示，使用SPSS18.0統(tǒng)計軟件處理，各項心功能指標以復灌穩(wěn)定后測得與實驗開始基礎值的百分比表示。采用方差分析和t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 心臟血流動力學指標的影響 隨著離體心臟保存時間的增長，心功能指標恢復率（復灌穩(wěn)定后測得指標與實驗開始基礎值之比，以百分比表示）逐漸降低。實驗組4 h、6 h與對照組比較，心功能指標恢復率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），8 h實驗組與對照組比較，心功能各項指標恢復率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。提示異氟烷預處理可以改善離體心臟低溫保存效果，但在冷保存6 h以內無明顯差異。詳見表1。

表1 不同保存時間再灌注30 min后心功能指標恢復率（±s） %

表1 不同保存時間再灌注30 min后心功能指標恢復率（±s） %

注：LVEDP為左心室舒張末壓；LVDP為左心室舒張壓；LVSP為左心室收縮壓；＋dp／dtmax為左心室最大壓力上升速率；-dp／dtmax為左心室最大壓力下降速率。與對照組同時間比較，1）P＜0.05

組別 n LVEDP LVDP LVSP ＋dp／dtmax -dp／dtmax實驗組 4 h 6 89.20±3.12 86.70±16.41 84.74±4.60 90.03±13.45 90.73±14.51 6 h 6 80.45±3.58 84.34±12.71 80.22±5.51 86.31±11.75 84.76±12.22 8 h 6 61.42±4.221） 66.89±15.121） 75.01±4.811） 71.63±9.851） 68.83±10.141）對照組 4 h 6 88.45±4.45 87.41±12.61 86.40±3.31 91.21±11.32 91.05±12.52 6 h 6 81.44±4.24 86.35±14.71 82.21±3.13 88.64±13.35 87.85±10.06 8 h 6 67.57±6.90 60.36±14.32 65.22±2.61 67.30±11.43 72.70±12.75

2.2 冠脈流出液中CK、LDH含量的影響 離體心臟保存前取各組平衡灌注冠脈流出液基礎值，各組間差異無統(tǒng)計學意義。隨著離體心保存時間的延長，各組心肌酶CK、LDH均有不同程度升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。實驗組4 h、6 h與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），實驗組8 h與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表2。

3 討 論

缺血預處理是在首次一定時間缺血后對再次缺血的耐受力提高現(xiàn)象，這一現(xiàn)象在臨床上心肌缺血及缺血再灌注方面具有實用價值，但人工造模生成缺血在臨床上無法進行，應用藥物提高缺血閾值（藥物預處理，APC）即成為臨床醫(yī)生的期望，故本實驗對此進行探討。

缺血預處理的保護作用可分為兩個時相，即早期保護（early phaseof protection，EP），指心肌在預處理后其抗損傷的能力立即明顯增強，約可持續(xù)1 h～3 h。二是延遲保護（delayed phase of protection，DP），指預處理后24 h再次出現(xiàn)的抗損傷能力，這是心肌的亞急性適應保護反應，出現(xiàn)后約可持續(xù)2 d～3 d。上述二者之間不存在連續(xù)過程。即預處理后馬上出現(xiàn)抗損傷能力，2 h～4 h后消失，24 h后又出現(xiàn)，持續(xù)2 d～3 d后消失?，F(xiàn)有研究認為［2］，EP的抗損傷能力是激活機體現(xiàn)有的各種抗損傷效應子，因此出現(xiàn)快、持續(xù)時間短。而DP抗損傷能力是機體通過抗損傷基因的復制、轉錄、翻譯產(chǎn)生新的抗損傷效應子，二者之間的中斷過程就是新的抗損傷效因子的產(chǎn)生過程。因此，DP的起效慢、作用時間長。

EP減少心肌梗死面積的能力比DP強［3］。但DP不僅能減少心肌梗死面積，而且能抗心律失常［4］和心肌頓抑（Stuning）［5］。EP不能反復刺激出現(xiàn)［6］，即在長時間缺血再灌注前，不論給予多少次的預處理，其抗損傷能力不能加強，持續(xù)時間也不會延長。而DP可以反復刺激出現(xiàn)［7］，即在長時間缺血再灌注前24 h給予預處理產(chǎn)生抗損傷能力，2 d～3 d后再給予預處理，其抗損傷能力仍可出現(xiàn)。有資料表明反復DP處理可使心肌的抗損傷能力持續(xù)10 d［8］。因此，DP比EP有更廣闊的臨床應用前景。假設在供心保存前馬上給予心臟預處理，其抗損傷能力僅能在術中體現(xiàn)，保存后沒有體現(xiàn)。而在供心保存前24 h給予預處理，心肌的抗損傷能力在術中及整個供心保存期間均能體現(xiàn)。

吸入麻醉藥是一類對心肌可以產(chǎn)生負性變力的藥物，臨床應用因其降低心肌耗氧量，從而對心肌有一定類似IP的保護作用［9，10］。本實驗采用Langendorff立體心臟灌注模型，排除了神經(jīng)、體液因素和心臟前、后負荷的影響。以目前臨床常用吸入麻醉藥-異氟烷進行心肌藥物預處理，且在實驗前24 h給藥，使藥物完全代謝，排除異氟烷本身直接的抗心肌缺血效應。更加確切了異氟烷的藥物預處理的心肌保護作用。目前麻醉藥物除應用于麻醉、疼痛治療和ICU使用外，尚無其他的臨床治療作用，麻醉藥物預處理的研究為麻醉藥物的應用開辟了一個新的方向。

LVEDP、-dp／dtmax是反映出左心室舒張期順應性及心肌保存后僵硬程度的指標之一，其中LVEDP在評價缺血再灌注損傷方面比LVDP更為敏感［11］，所以在低溫保存供心后再灌注過程中，動態(tài)觀察左室功能中加入LVDEP的變化用來判斷心肌損傷程度。實驗中，置入左心室的水囊體積恒定，因而水囊內的壓力變化可以反映LVEDP的變化，測量出左心室的順應性。本實驗結果顯示，低溫保存8 h，各項心功能指標實驗組較對照組均明顯改善，但保存4 h與6 h實驗組與對照組差異無統(tǒng)計學意義。8 h實驗組復灌后心功能指標LVDP、LVSP、＋dp／dtmax明顯好于對照組，表明異氟烷預處理可以提高收縮功能；LVEDP、-dp／dtmax上升程度8 h實驗組低于對照組，表明異氟烷可以改善再灌注后心肌舒張功能，降低心肌僵硬程度。根據(jù)以上心功能指標可以看出異氟烷預處理可以提高低溫保存8 h的離體心功能，但對于低溫保存6 h以內離體心功能無明顯影響。

因為再灌注損傷和細胞膜通透性增高，心肌中豐富的酶大量漏出，致使冠脈流出液中心肌酶濃度升高，酶學指標水平與細胞壞死量密切相關，從其水平有助于判斷心肌細胞損傷程度［12］。本實驗中，冷保存后心肌酶均有不同程度升高，且隨時間延長，心肌酶升高越加明顯。8 h實驗組與對照組之間心肌酶CK、LDH升高程度差異有統(tǒng)計學意義，提示異氟烷可以減輕再灌注心肌細胞的損傷。

本實驗結果提示異氟烷在8 h組具有心肌保護作用，這與冷保存離體心臟特點有關，相關文獻指出［13］，冷保存8 h是心肌能量儲存急劇下降，心功能顯著減退的關鍵階段，HTK液在6 h內心肌保護效果好，雖然各項試驗指標有輕度下降，但差異無統(tǒng)計學意義，超過6 h保存效果下降明顯。目前臨床上常用的單次灌注低溫保存是一種安全、簡單而且經(jīng)濟的方法，國際公認此法保存心臟時限一般在4 h～5 h，但國外有報道，認為供體心臟保存8 h以上已經(jīng)不再是心臟移植的禁忌證［14］，國內也報道了3例供心離體保存6 h～9 h后行心臟移植獲得成功的病例［15］。而本實驗異氟烷在心臟離體保存8 h中的心肌保護作用，恰好為超過一般保存時限的心臟移植提供了幫助，具有臨床實踐意義。

本實驗未能對冷保存時間大于8 h進行觀察，且對異氟烷具體預處理影響的具體機制還有待進一步研究。

本實驗采用異氟烷預處理，實驗組在缺血前采用腹腔注射實驗劑量的異氟烷，經(jīng)24 h取離體心臟進行冷保存后心功能指標恢復情況，通過測定心肌酶及心肌力學指標，評價異氟烷的作用效果，結果顯示在腹腔預先注射異氟烷后，冷保存8 h心臟恢復較佳。

［1］ Murry CE，Jennings RB，Reimer KA，et al.Preconditioning with ischemia：A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium［J］.Circulation，1986，74（5）：1124-1136.

［2］ Foadoddini M，Esmailidehaj M，Mehrani H，et al.Pretreatment with hyperoxia reduces in vivo infarct size and cell death by apoptosis with an early and delayed phase of protection［J］.Eur J Car-diothorac Surg，2011，39（2）：233-240.

［3］ Cohen MV，Baines CP，Downey JM.Ischemic preconditioning：Fromadenosine receptor to KATPchannel［J］.Annu Rev Physiol，2000，62：79-109.

［4］ Roberto B.The late phase of preconditioning［J］.Circ Res，2000，87：972.

［5］ Tang XL，Qiu Y，Park SW，et al.Time course of late preconditioningagainst myocardial stunning in conscious pigs［J］.Circ Res，1996，79（3）：424-434.

［6］ Cohen MV，Yang XM，Downey JM.Conscious rabbits become tolerant tomultiple episodes of ischemic preconditioning［J］.Circ Res，1994，74：998-1004.

［7］ Dana A，Baxter GF，Walker JM，et al.Prolonging the delayed phase of myocardial protection：Repetitive adenosine A1receptoractivation maintains rabbit myocardium in a preconditioned state［J］.J Am Coll Cardiol，1998，31：1142-1149.

［8］ Baxter GF，Yellon DM.Time course of delayed myocardial protectionafter transient adenosine A1receptor activation in the rabbit［J］.J Cardiovasc Pharmacol，1997，29：631-638.

［9］ Bemard JM.Effects of sevoflurane and isoflurane on cadiac and coronary dynamics inchronically instrumented dogs［J］.Anesthesilogy，1990，72：659-662.

［10］ Navalija E，F(xiàn)ujita S，Kampine JP，et al.Sevoflurane mimics ischemic preconditioning effects on coronary flow and nitric oxide release in isolated hearts［J］.Anesthesilogy，1999，91：701.

［11］ Thomson DA，Waldron CB，Junl SM，et al.Analysis of left ventricular pressure during isovolumic relaxation in coronary artery disease［J］.Circulation，1982，65：690.

［12］ 葉任高.內科學［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：301.

［13］ Cannon MB，Vine AJ，Kantor HL，et al.Warm and cold blood cardioplegia：Comparison of myocardial function and metabolism using SP magnetic resonance spectroswpy［J］.Circulation，1994，90（2）：329-338.

［14］ Hosseinzadeh T.Adverse effect of prearrest hypothermia in immature hearts：Rate versus duration of cooling ［J］.Ann Thorac Surg，1992，53（3）：464-471.

［15］ Lahorra JA，Torchiana DF，Tolis G，et al.Rapid cooling contracture with cold cardioplegia ［J］.Ann Thorac Surg，1997，63（5）：1353-1360.