陳書艷，蔡曉陽，吳 奇，史海健

(南京工業(yè)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江蘇南京 210009)

螢火蟲熒光素存在于螢火蟲的發(fā)光細(xì)胞中，它對三磷酸腺甙(ATP)十分敏感，可用于ATP含量測定［1］。在臨床醫(yī)療、生命科學(xué)研究以及食品衛(wèi)生檢測和環(huán)境監(jiān)測分析等方面得到了廣泛的應(yīng)用。其衍生物甲基熒光素也具有很好的生物醫(yī)學(xué)造影，報告基因等應(yīng)用［2，3］。

穩(wěn)定性同位素及其化合物之間的化學(xué)性質(zhì)和生物性質(zhì)是相同的，只是具有不同的核物理性質(zhì)。因此，可以用穩(wěn)定性同位素作為示蹤原子，制成含有穩(wěn)定性同位素標(biāo)記化合物，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、生物學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)、分析測試等領(lǐng)域。如在醫(yī)學(xué)上，該技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于臨床研究、多種疾病的診斷與鑒別、病情判斷、治療效果評價、臟器功能研究和新藥開發(fā)等方面［4～6］。因此研究氘代的甲基熒光素的合成具有十分重要的意義。

本文在前期研究工作［7］的基礎(chǔ)上，以2-氰基-6-甲氧基苯并噻唑(1)為原料，經(jīng)脫甲基、氘甲基化，再與D-半胱氨酸鹽酸鹽水合物反應(yīng)合成了新化合物——氘代甲基螢火蟲熒光素(4，Scheme 1)，總收率46%，對映選擇性100%。1與D-半胱氨酸鹽酸鹽水合物反應(yīng)合成了甲基螢火蟲熒光素(5，Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，F(xiàn)T-IR和 MS表征。

該方法具有原料價廉易得，反應(yīng)條件溫和，純度好及收率較高等優(yōu)點(diǎn)，為生物檢測提供了重要試劑。

Scheme 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

X-4型顯微熔點(diǎn)儀(溫度未校正);Bruker MD 300(或500)MHz型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo));Nicolet AVATAR-360型紅外光譜儀(KBr壓片);VG-ZAB-MS型質(zhì)譜儀(70 eV)。

1按文獻(xiàn)［7］方法合成;其余所用試劑均為分析純，其中二氯甲烷和DMF用前經(jīng)干燥處水。

1.2 合成

(1)2-氰基-6-羥基-苯并噻唑(2)的合成

在反應(yīng)瓶中加入BBr31.4 mL(15 mmol)和二氯甲烷`15 mL，攪拌下于-78℃滴加1 0.5 g(2.6 mmol)的二氯甲烷(5 mL)溶液，滴畢，于室溫反應(yīng)15 h(TLC監(jiān)測)。用飽和NH4Cl溶液淬滅反應(yīng)，用乙酸乙酯(2×10 mL)萃取，合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥，減壓除去溶劑后經(jīng)硅膠柱層析［洗脫劑:A=V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=10∶1］純化得無色晶體2 0.1 g，收率60%，m.p.212 ℃ ～215 ℃;1H NMR δ:10.5(s，1H)，8.04(d，J=9.0 Hz，1H)，7.17(dd，J=9.0 Hz，2.4 Hz，1H)，7.57(d，J=2.4 Hz，1H);IR ν:3 428，3 216，3 074，2 228，1 600，1 461，1 438，1 239 cm-1。

(2)2-氰基-6-氘代甲氧基苯并噻唑(3)的合成

在反應(yīng)瓶中加入 2 0.1 g(0.57 mmol)，K2CO30.157 g(1.14 mmol)及 DMF 10 mL，N2保護(hù)，攪拌下于 0℃ 加入 CD3I 0.05 mL(0.80 mmol);于60℃反應(yīng)11 h(TLC監(jiān)測)。加入飽和亞硫酸鈉淬滅反應(yīng)，用乙酸乙酯(2×5 mL)萃取，合并有機(jī)相層，用無水硫酸鈉干燥，減壓蒸除溶劑后經(jīng)硅膠柱層析(A=1∶10)純化得白色固體3 103 mg，收率 95%，m.p.121 ℃ ～123 ℃;1H NMR δ:8.13(d，J=9.0 Hz，1H)，7.89(d，J=3.0 Hz，1H)，7.35 ～7.31(m，1H);MSm/z:194{［M+H］+，100%}。

(3)4的合成

在圓底燒瓶中加入3 50 mg(0.26 mmol)和甲醇3 mL，攪拌使其溶解;加入D-半胱氨酸鹽酸鹽水合物35 mg(0.2 mmol)的甲醇(5 mL)溶液;加入10%K2CO3溶液至 pH 7.5，于室溫反應(yīng)1.5 h(TLC 監(jiān)測反應(yīng))。加水 50 mL，用 1 mol·L-1鹽酸調(diào)至pH 3，產(chǎn)生沉淀，過濾，濾餅干燥得淡黃色固體4 60 mg，收率80%，m.p.182℃ ～185℃，［α］-42.85°(c0.01，THF);1H NMR δ:13.14(s，1H)，8.04(d，J=5.5 Hz，1H)，7.76(d，J=1.5 Hz，1H)，7.21 ～ 7.19(dd，J=1.5 Hz，1.5 Hz，1H)，5.43 ～5.40(m，1H)，3.80 ～3.76(m，1H)，3.70 ～3.66(d，1H);MSm/z:297{［M+H］+，100%}。

(4)5的合成

在反應(yīng)瓶中加入1 0.31 g(1.63 mmol)，D-半胱氨酸鹽酸水合物0.288 g(1.64 mmol)，甲醇15 mL及水10 mL，攪拌下加入K2CO30.145 g(淡黃色逐漸變淺，有氣體放出)，攪拌10 min(TLC監(jiān)測)。旋蒸除甲醇，殘余液用 0.1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)至pH 8.5，用乙酸乙酯(2×10 mL)萃取，水層用1 mol·L-1鹽酸調(diào)至 pH 1 ～2，有大量白色固體析出，過濾，濾餅干燥得白色固體5 0.38 g，收率80%，m.p.173 ℃ ～174 ℃，［α］D20-44.8°(c1.2，THF);1H NMR δ:8.04(d，J=8.9 Hz，1H)，7.76(d，J=2.6 Hz，1H)，7.21(dd，J=8.9 Hz，2.6 Hz，1H)，5.42(t，J=9.6 Hz，1H)，3.87(s，3H)，3.66 ～3.80(m，2H);IR ν:3 437，2 972，2 927，1 733，1 586，1 492，1 260，1 215，1 060，1 023，909，868 cm-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

在2的合成中，分別采用了吡啶鹽酸鹽和BBr3作為去甲基試劑。前者反應(yīng)溫度高達(dá)190℃，吡啶鹽酸和1在熔融狀態(tài)下反應(yīng)，收率較高(80%)，但分離困難，純度低。后者采用BBr3作為去甲基試劑，收率較低(60%)，但反應(yīng)操作和后處理較為方便，純度也較高。

3的合成用CD3I與2在堿性條件下進(jìn)行Williamson反應(yīng)。實驗結(jié)果表明，反應(yīng)溫度為60℃時收率較高(95%)。

在4的合成中，采用仿生合成的方法，利用半胱氨酸鹽酸鹽水合物作為手性底物參與不對稱合成，有效的得到手性單一的產(chǎn)物——D-(-)-氘代甲基熒光素，對映選擇性高達(dá)100%。反應(yīng)在室溫，避光，氮?dú)獗Ｗo(hù)，堿性條件下順利進(jìn)行，收率較高(80%)。

2.2 表征

在3的1H NMR分析表明，4-H在8.13處出現(xiàn)一個雙峰，7-H在7.89處出現(xiàn)一個雙峰，5-H多重峰及7-H雙峰的出現(xiàn)應(yīng)該是彼此的氫遠(yuǎn)程效應(yīng)所導(dǎo)致的。與1的1H NMR譜圖［1H NMR(DMSO-d6)δ:8.14(d，J=9.1 Hz，1H)，7.86(d，J=2.5 Hz，1H)，7.32(dd，J=2.6 Hz，9.2 Hz，1H)，3.88(s，3H)］相比，3 的1H NMR 譜圖中3.88處的CH3O處的甲基氫消失了，氘代比較完全。

在4的1H NMR分析表明，羧酸氫在13.11處呈現(xiàn)多重峰，4-H在8.09處出現(xiàn)一個雙峰，5-H在7.19 ～7.21 處出現(xiàn)一個 dd 峰，7-H 在7.76處出現(xiàn)一個雙峰，5-H dd峰及7-H雙峰的出現(xiàn)應(yīng)該是彼此的氫遠(yuǎn)程效應(yīng)所致。4'-H在5.40～5.46處出現(xiàn)一個多重峰，5'-H分別出現(xiàn)在3.70和3.79處。和5相比，氘代甲基熒光素的1H NMR譜圖中3.87處CH3O處的甲基氫消失了，確證了該化合物的結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

設(shè)計了一條新的氘代甲基熒光素的全合成路線。經(jīng)過實驗條件考察確定了三溴化硼脫甲基方法，簡化了反應(yīng)操作。并采用Williamson反應(yīng)在堿性條件下順利與氘代碘甲烷反應(yīng)，再經(jīng)與手性半胱氨酸堿性條件下反應(yīng)，順利地完成了氘代甲基螢火蟲熒光素的全合成，總收率達(dá)到46%，對映選擇性達(dá)100%。與文獻(xiàn)［1］方法相比，該法具有工藝更簡單、總產(chǎn)率更高、操作更安全等特點(diǎn)，具有實際應(yīng)用價值。該新穎氘代化合物對擴(kuò)展熒光素的生物研究意義重大。

［1］Theodossiou T，Hothersall J S，Elizabeth A，et al.Firefly lueiferin-aetivated rose bengal［J］.Cancer Research，2003，63:1818 -1821.

［2］Yao Z，Bai H，Li C，et al.Colorimetric and fluorescent dual probe based on a polythiophene derivative for the detection of cysteine and homocysteine［J］.Chemical Communications，2011，47(26):7431 -7433.

［3］Wang J-Q，Pollok K E，Cai S，et al.PET imaging and optical imaging with D-luciferin［11C］methyl ester and D-luciferin［11C］methyl ether of luciferase gene expression in tumor xenografts of living mice［J］.Bioorganic ＆ Medicinal Chemistry Letters，2006，16(2):331-337.

［4］郭波莉，魏益民，潘家榮.同位素溯源技術(shù)在食品安全中的應(yīng)用［J］.核農(nóng)學(xué)報，2006，20(2):148 -153.

［5］陳世蘋，白永飛，韓興國.穩(wěn)定性碳同位素技術(shù)在生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用［J］.植物生態(tài)學(xué)報，2002，26(5):549-560.

［6］Parikka K，Wahala K.Deuteration of dietary antioxidants:Ferulic acid derivatives and a-tocopheroly［J］.J Label Compd Radiopharm，2007，50:475 -476.

［7］祝曙英，吳奇，林成剛，等.熒光素的全合成［J］.合成化學(xué)，2010，18(5):633 -635.