孔慶波，施 念

（1.重慶警察學(xué)院，重慶401331；2.重慶市公安局刑警總隊(duì)，重慶401331）

隨著人類(lèi)基因組研究的深入，遺傳標(biāo)記技術(shù)相繼開(kāi)發(fā)，對(duì)人類(lèi)生命密碼的解讀越來(lái)越透徹。在此基礎(chǔ)上，相關(guān)領(lǐng)域的不斷融合、交叉和借鑒，致使法醫(yī)物證檢驗(yàn)技術(shù)在此領(lǐng)域也得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。從20世紀(jì)90年代STR分型技術(shù)逐漸應(yīng)用于法醫(yī)鑒定開(kāi)始，多達(dá)9個(gè)乃至15個(gè)STR位點(diǎn)的復(fù)合擴(kuò)增結(jié)合熒光自動(dòng)測(cè)序儀的使用，使法醫(yī)物證鑒定效率大幅度提高。然而，1997年SNPs標(biāo)記策略的提出［1］，在整個(gè)生物學(xué)界引起了基因多態(tài)性研究的新一輪熱潮，為法醫(yī)物證檢驗(yàn)發(fā)展提供了新的前景。

1 SNPs概述

1.1 SNPs的含義

SNPs是單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）的簡(jiǎn)稱(chēng)，指基因組內(nèi)特定核苷酸位置上存在著兩種不同的堿基，其中最少的一種在群體中的頻率不少于1%。SNPs主要是由基因組水平上的單個(gè)核苷酸變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNPs包括了人類(lèi)基因組已知多態(tài)性的80%，是最常見(jiàn)的遺傳變異類(lèi)型。與RFLP、STR相比，SNPs更廣泛地存在于基因組中，分布密度及數(shù)量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于其他類(lèi)型的DNA多態(tài)性。SNPs在單個(gè)基因或整個(gè)基因組中并不是均勻分布的。

1.2 SNPs的應(yīng)用

SNPs分析在遺傳學(xué)、醫(yī)學(xué)研究上發(fā)揮著巨大的作用，其主要用途可歸納為以下三個(gè)方面［2］：

（1）醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)方面：SNPs在同一位點(diǎn)上較少的多態(tài)性和在基因組中的豐富性，使之適合于自動(dòng)化大規(guī)模掃描，成為第3代遺傳圖譜標(biāo)記技術(shù)，標(biāo)記密度可從10cm提高至1cm～2cm。在此基礎(chǔ)上，可進(jìn)行疾病遺傳學(xué)研究。

（2）群體遺傳學(xué)方面：通過(guò)對(duì)比人群之間SNPs圖譜的異同程度，研究人類(lèi)進(jìn)化過(guò)程中的起源與分流［3］。

（3）藥物基因組學(xué)（pharmacogenomics）方面：通過(guò)研究與藥物活化、代謝或靶分子有關(guān)基因的SNPs，找出不同個(gè)體對(duì)藥物敏感性或耐受性的相關(guān)基因［4］，實(shí)現(xiàn)個(gè)性化醫(yī)療。

進(jìn)行法醫(yī)學(xué)應(yīng)用性研究主要是在群體遺傳學(xué)方面，包括種屬特異性、同質(zhì)性、遺傳方式、突變率等。SNPs序列較短，尤其適用于高度腐敗、降解、陳舊的法醫(yī)生物檢材。

2 SNPs檢驗(yàn)在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

正常男性擁有一條Y染色體，正常女性沒(méi)有Y染色體。Y染色體的性別決定功能意味著他是父系遺傳，且呈單倍型向下傳遞，不發(fā)生重組，除積累的突變外，由父親無(wú)變化的將其傳遞給兒子。Y染色體遺傳標(biāo)記的這些特征，使SNPs在法醫(yī)學(xué)中具有獨(dú)特、潛在的巨大作用［5］。

2.1 SNPs檢驗(yàn)應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)的方法

2.1.1 SNPs檢驗(yàn)應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)SNPs只涉及單個(gè)堿基的變異，因而檢驗(yàn)SNPs意味著從單核苷酸水平對(duì)每個(gè)個(gè)體的DNA序列多態(tài)性進(jìn)行最本質(zhì)的鑒別和區(qū)分，這在法醫(yī)個(gè)人識(shí)別和親子鑒定中具有巨大的意義。同其它遺傳標(biāo)記相比，SNPs具有以下適用于法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)［2］：

（1）SNPs位點(diǎn)含量的豐富性及分布的高密度性。雖然SNPs單位點(diǎn)可以提供的信息相對(duì)較少，但分布的高密度彌補(bǔ)了信息量的不足。

（2）SNPs的遺傳穩(wěn)定性。SNPs被認(rèn)為是一種能穩(wěn)定遺傳的早期突變，較STR等多態(tài)標(biāo)記具有更高的遺傳穩(wěn)定性［6］，這對(duì)于親子鑒定來(lái)說(shuō)更有意義。

（3）SNPs檢驗(yàn)技術(shù)自動(dòng)化的可行性。SNPs標(biāo)記作為雙等位基因，結(jié)果只表現(xiàn)為簡(jiǎn)單的“＋／-”或“有／無(wú)”形式，這使SNPs的檢驗(yàn)方法易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化或全自動(dòng)化。

2.1.2 SNPs檢驗(yàn)應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)的方法 以下為近年來(lái)法醫(yī)物證檢驗(yàn)常用的幾種較有前景的SNPs高通量檢驗(yàn)技術(shù)：

（1）DNA 芯片技術(shù)：DNA 芯片（DNA chip，又稱(chēng)基因芯片，生物芯片）技術(shù)和照相平板印刷技術(shù)的有機(jī)結(jié)合以及激光共聚焦顯微技術(shù)的引入，使核酸雜交技術(shù)實(shí)現(xiàn)集成化，可以一次性對(duì)樣品大量序列進(jìn)行實(shí)時(shí)、靈敏、準(zhǔn)確的檢驗(yàn)和分析。法醫(yī)DNA檢驗(yàn)的未來(lái)有賴(lài)于DNA芯片技術(shù)的應(yīng)用，快速檢驗(yàn)幾百個(gè)SNPs多態(tài)性位點(diǎn)，并有希望制成小型化的現(xiàn)場(chǎng)包。在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，將以DNA芯片為基礎(chǔ)技術(shù)，建立第三代DNA分析技術(shù)。

（2）寡核苷酸連接檢驗(yàn)（oligonucleotide ligation assay，OLA）技術(shù)［6］：該方法可使法醫(yī)SNPs檢驗(yàn)進(jìn)一步自動(dòng)化。

（3）MALDI-TOFMS（matrix-assisted laser desorption／ion-ization mass spectrometry）檢驗(yàn)技術(shù)：對(duì)SNPs檢驗(yàn)而言，以下兩種方法較有前景，即肽核酸（peptide nucleicacid，PNA）探針技術(shù)和引物延伸技術(shù)（primerextension）（也稱(chēng)為微測(cè)序技術(shù)），可實(shí)現(xiàn)對(duì)SNPs的高通量檢驗(yàn)［7］。

（4）Taq Man熒光探針技術(shù)［8］：Taq Man技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR的實(shí)時(shí)定量檢驗(yàn)，并且因整個(gè)反應(yīng)過(guò)程一次加樣，在密封體系中進(jìn)行，可將PCR污染的風(fēng)險(xiǎn)降至最低。

（5）其他新方法：近年來(lái)，進(jìn)行SNPs分型的新技術(shù)層出不窮，如等溫環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（isothermal rolling circle amplification，RCA）、溫度調(diào)控高效液相色譜技術(shù)（temperature-modulated high-performance liquid chroma-tography，TmH PLC）、焦磷酸測(cè)序法（pyrosequencing）等。

2.2 SNPs檢驗(yàn)在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景

2.2.1 在個(gè)體識(shí)別中的應(yīng)用 性別鑒定是法醫(yī)學(xué)中個(gè)體識(shí)別的重要內(nèi)容之一。以往進(jìn)行性別鑒定通常檢驗(yàn)Y染色質(zhì)、性激素、男女之間的差異性蛋白等來(lái)判斷。由于對(duì)檢材的要求較高，在實(shí)踐檢案中難以應(yīng)用。在個(gè)體識(shí)別中的另一應(yīng)用是身份鑒定，SNPs在法醫(yī)學(xué)上與選擇性STR位點(diǎn)有著同樣的功能，它們?yōu)樯矸蓁b別提供了基因信息。

DNA在各種生物學(xué)檢材中比較穩(wěn)定，而且檢驗(yàn)技術(shù)穩(wěn)定、靈敏，已廣泛應(yīng)用于法醫(yī)的實(shí)踐中。特別是以SNPs為代表的新一代遺傳標(biāo)記。SNPs是人類(lèi)基因組中最常見(jiàn)、分布最廣泛的DNA多態(tài)性類(lèi)型，大約90%的人類(lèi)遺傳變異是單核苷酸多態(tài)性。研究表明，SNP數(shù)比微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)要高出幾個(gè)數(shù)量級(jí)。SNPs是二等位基因，多態(tài)信息含量不如多等位基因STR［9］，但其比STR更易通過(guò)擴(kuò)增，在人群中容易通過(guò)各種不同的方法確定等位基因頻率，而且篩選只需通過(guò)有或無(wú)的分析。

目前，已經(jīng)有一些SNPs鑒定試驗(yàn)應(yīng)用于個(gè)人識(shí)別的報(bào)道，如由歐洲法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的21SNPs嵌板和 52SNPs嵌板［10］。與此同時(shí)，Kidd K K等［11］舉例說(shuō)明了身份鑒定SNPs位點(diǎn)的選擇和嵌板的研發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。用這種標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)估的結(jié)果是在40個(gè)人群中篩選出19個(gè)具有高度雜合性和低的Fst值的身份鑒定SNPs。進(jìn)一步的研究已經(jīng)在進(jìn)行中，將會(huì)鑒定出更多符合的SNPs以滿足當(dāng)前身份鑒定的需要。

2.2.2 在親權(quán)鑒定中的應(yīng)用 SNPs標(biāo)記數(shù)目多，覆蓋密度大，在法醫(yī)鑒定中具有巨大的潛力。SNPs多態(tài)性雖然發(fā)現(xiàn)才短短幾年，由于突變率低，相對(duì)穩(wěn)定，在法醫(yī)學(xué)中的親權(quán)鑒定應(yīng)用價(jià)值極大。通過(guò)Y染色體的SNPs單倍型分析，當(dāng)孩子是男孩，親權(quán)鑒定出現(xiàn)疑問(wèn)或者沒(méi)有母親參與時(shí)，通過(guò)對(duì)Y染色體SNPs單倍型的分析，可進(jìn)行單親的父子對(duì)親子鑒定。利用Y染色體的SNP單倍型（男性特異性）分析，還可以進(jìn)行兄弟關(guān)系、叔侄關(guān)系、爺孫關(guān)系的鑒定等。

中華民族的家系以父系姓氏為主，海外僑胞、知名人士尋根問(wèn)祖需鑒定是否為同一父系宗親，財(cái)產(chǎn)繼承需鑒定是否具有父系親緣關(guān)系等，檢驗(yàn)Y染色體遺傳標(biāo)記顯然有其他檢驗(yàn)手段無(wú)法替代的作用。

2.2.3 在推測(cè)個(gè)體生物地理起源中的應(yīng)用 個(gè)體的生物地理起源可以間接地提供一些一般的外貌信息，對(duì)調(diào)查有指導(dǎo)價(jià)值。法醫(yī)學(xué)STR位點(diǎn)雖然是很好的鑒定標(biāo)記，但它們不適合用來(lái)定義個(gè)體的生物地理起源，因?yàn)槿巳褐械牡任换蚴歉叨裙蚕淼?。Y染色體和線粒體DNA單倍型因其是單親遺傳和有限的人類(lèi)基因組代表性也不能作為表型的間接預(yù)測(cè)標(biāo)記。而始祖多態(tài)位點(diǎn)（AIMs）是遍布于人類(lèi)基因組的SNPs，并且在世界不同人群中的出現(xiàn)頻率不同。它們能夠判斷樣本的生物地理起源，從而間接地推測(cè)一些表型特點(diǎn)，但不能檢驗(yàn)出外貌特征，因而是一種表型評(píng)價(jià)的間接方法［12］。這種方法是以人群家系結(jié)構(gòu)與某些表型表達(dá)的相關(guān)性為基礎(chǔ)的。例如，北歐人的皮膚色素沉著比其他地區(qū)的人更淺，利用合適的數(shù)據(jù)庫(kù)可以定義不同區(qū)域人群的皮膚色素沉著程度，并將其作為始祖起源參照，則淺膚色的證據(jù)樣本可以定位在北歐地區(qū)。

這種始祖基因測(cè)試已經(jīng)在2003年成功應(yīng)用于美國(guó)路易斯安那州連環(huán)殺人案的調(diào)查。證物的AIMs分析結(jié)果指出，犯罪嫌疑人為非裔的可能性為85%，因而間接推測(cè)出犯罪嫌疑人為深色皮膚，為調(diào)查提供了線索。

2.2.4 在推測(cè)不同個(gè)體表型特點(diǎn)中的應(yīng)用 AIMs可以提供關(guān)于犯罪嫌疑人外表的有用信息，它們是間接傳遞生物地理家系個(gè)體表型的唯一方式，但在描述個(gè)體外表的價(jià)值上是有限的，而且要根據(jù)具體案例情況考慮其應(yīng)用的價(jià)值［12］。描述表型特點(diǎn)的DNA標(biāo)記要能進(jìn)行更加準(zhǔn)確的外表遺傳學(xué)預(yù)測(cè)，從而識(shí)別犯罪者。在人類(lèi)學(xué)研究中，它們對(duì)利用人體遺物進(jìn)行面部重構(gòu)具有重要價(jià)值。作為直接的方法，它需要評(píng)估顯著影響特殊表型的基因變異并開(kāi)發(fā)與特殊表型相關(guān)的基因變異的數(shù)據(jù)庫(kù)。個(gè)人外表最明顯的標(biāo)記是膚色、身高和面部特征，它們都是有高度遺傳性的。因此，測(cè)定SNPs是可行的，而且對(duì)預(yù)測(cè)不同表型特點(diǎn)有重大意義。

大量色素基因中的SNPs與各種人群頭發(fā)、皮膚和眼睛顏色的表型相關(guān)。頭發(fā)、皮膚和眼睛顏色的遺傳基礎(chǔ)在動(dòng)物模型上已經(jīng)得到很好的解釋?zhuān)壳盀橹龟P(guān)于表型SNPs的主要工作仍集中在色素沉著上。迄今為止，對(duì)于很多色素沉著復(fù)雜多基因特性的遺傳基礎(chǔ)已經(jīng)成功闡述，為其他高遺傳性狀成因的SNPs的研究提供了希望，如身高和面部形態(tài)基因的應(yīng)用將成為可能。

2.2.5 在某些案件中的獨(dú)特應(yīng)用 與常染色體遺傳標(biāo)記相比，對(duì)輪奸案、強(qiáng)奸案等案件提取的混合檢材進(jìn)行鑒定時(shí)，Y染色體遺傳標(biāo)記擴(kuò)增分型技術(shù)更有其特殊的價(jià)值，獲得的單倍型結(jié)果不受女性成分影響。文獻(xiàn)［13-14］報(bào)道將男性與女性的血液混合提取DNA，對(duì)模板進(jìn)行Y-SNPs位點(diǎn)的復(fù)合檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)男女成分比例為1 000∶1時(shí)仍能得到正確分型，不受女性成分的影響。當(dāng)犯罪嫌疑人樣本無(wú)法獲得時(shí)，還可通過(guò)取其父系的任何一個(gè)男性個(gè)體的生物檢材作Y染色體遺傳標(biāo)記進(jìn)行排查分析，達(dá)到節(jié)約費(fèi)用，縮小排查范圍的目的。

另外，Y染色體SNPs分布具有明顯的地域性，可用于進(jìn)行犯罪現(xiàn)場(chǎng)遺留的生物學(xué)個(gè)體所屬群體的推斷。這將為法醫(yī)案件偵破提供新的研究思路。

3 存在的問(wèn)題

通過(guò)上述的研究?jī)?nèi)容可知，SNPs用于法醫(yī)學(xué)具有可行性，而且具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但目前SNPs檢驗(yàn)在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)嶋H應(yīng)用中還存在諸多需要解決的問(wèn)題。

（1）已有的大量研究表明，從生物檢材中檢驗(yàn)有用的SNPs要比人們想象的困難得多。

（2）雖然Y-SNPs作為新一代遺傳標(biāo)記，在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景，但是Y-SNPs的多態(tài)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Y-STR，因此建立一個(gè)適合法醫(yī)學(xué)應(yīng)用的多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的Y-SNPs復(fù)合檢驗(yàn)體系需要更多的Y-SNPs位點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)難度大，且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存在檢驗(yàn)步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、過(guò)于敏感等，可能會(huì)得到假陽(yáng)性、陰性結(jié)果。

（3）在SNPs檢驗(yàn)技術(shù)方面，DNA芯片技術(shù)目前在樣品的制備、探針合成與固定、分子的標(biāo)記、數(shù)據(jù)的讀取與分析等各個(gè)環(huán)節(jié)仍然存在著許多難以解決的問(wèn)題，加之基因芯片技術(shù)對(duì)特殊儀器的依賴(lài)，技術(shù)成本昂貴、復(fù)雜，限制了其實(shí)際應(yīng)用；MALDITOFMS技術(shù)則耗費(fèi)過(guò)高，設(shè)施要求高，國(guó)內(nèi)許多實(shí)驗(yàn)室還無(wú)法開(kāi)展；另外，高通量SNPs篩查所需技術(shù)雖然自動(dòng)化程度高，但費(fèi)用要比STR檢驗(yàn)高，目前條件下大批量擴(kuò)增和檢驗(yàn)所產(chǎn)生的錯(cuò)誤率過(guò)高，這也是阻礙其推廣使用的原因之一。

（4）世界上各種族和民族間的差異較大，每一SNPs在不同的人群可能會(huì)有不同的價(jià)值，因此，當(dāng)SNPs用于法庭科學(xué)時(shí)，需調(diào)查不同種族和民族的SNPs多態(tài)性頻率。Kidd K K等［11］認(rèn)為只有1／3的SNPs可用于群體遺傳學(xué)，而不像STR位點(diǎn)已經(jīng)獲得大量的各種族和民族多態(tài)性頻率資料，能成熟地應(yīng)用于法醫(yī)個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定。我國(guó)這一工作仍處于起步階段。

（5）由于目前對(duì)于Y-SNPs的檢驗(yàn)尚未建立穩(wěn)定的、適合親權(quán)鑒定的復(fù)合體系，因此，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)將Y-SNPs應(yīng)用于親權(quán)鑒定案例的報(bào)道，這將是法醫(yī)DNA分析的一個(gè)研究方向。

總之，SNPs應(yīng)用要想在國(guó)內(nèi)普及開(kāi)來(lái)，以至于取代STR成為新一代的法醫(yī)物證的核心，還需在許多方面做進(jìn)一步研究和大量的工作。但是，SNPs標(biāo)記在法醫(yī)學(xué)樣本分析的一些特殊領(lǐng)域?qū)?huì)發(fā)揮巨大的作用。如分析高度降解的檢材、提高親緣關(guān)系和家系重建的能力用于走失人口的鑒別等，同時(shí)也能為一些案件的調(diào)查提供重要線索。身份鑒定SNPs可能會(huì)最先應(yīng)用于日常工作，然后是系譜SNPs。SNPs個(gè)體生物地理起源推測(cè)和個(gè)體表型的推測(cè)將會(huì)應(yīng)用在更為專(zhuān)業(yè)的領(lǐng)域，成為提供案件調(diào)查線索的一種新思路。

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