虞 游，張艷歐，趙文鋮，白 堅(jiān)，陳建明

（杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310036）

喉癌是頭頸部常見惡性腫瘤，約占全身惡性腫瘤的5．7%～7．6%，近年來發(fā)病率有逐漸上升趨勢，但其發(fā)病機(jī)制還不清楚，已有資料表明喉癌發(fā)生除了與p53等腫瘤抑制基因有關(guān)外，高風(fēng)險人乳頭瘤病毒感染也能誘導(dǎo)喉癌發(fā)生．目前喉癌治療手段主要為手術(shù)、放療與化療3種方法，但預(yù)后往往不理想并且有很大毒副作用，因此，尋找喉癌發(fā)病相關(guān)基因，對于揭示喉癌發(fā)病分子機(jī)理以及喉癌早期診斷與預(yù)防都有重要作用［1－3］．

最近，我們用干擾素－γ（IFN－γ）處理培養(yǎng)的人喉癌細(xì)胞系Hep－2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)干擾素－γ能抑制Hep－2細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)干擾素可調(diào)控表達(dá)的IFI16基因表達(dá)，但不影響與IFI16基因同源的MNDA基因表達(dá)，我們推測干擾素－γ抑制Hep－2細(xì)胞增殖可能是通過誘導(dǎo)IFI16基因表達(dá)而介導(dǎo)［4］；Azzimonti等也報(bào)道IFI16基因表達(dá)高低與喉癌的增殖性及其預(yù)后好壞相關(guān)，增殖性低預(yù)后好的喉癌標(biāo)本中IFI16基因表達(dá)高，而增殖性高預(yù)后差的喉癌標(biāo)本中IFI16基因表達(dá)則低下［5］；由此推測，IFI16基因在喉癌細(xì)胞增殖中起抑制作用，本文以喉癌細(xì)胞系Hep－2細(xì)胞作為研究材料，通過構(gòu)建IFI16基因的增強(qiáng)綠色熒光蛋白融合表達(dá)載體，利用基因外來過表達(dá)探討IFI16基因在喉癌細(xì)胞增殖中的作用．

1 材料和方法

1．1 主要儀器

MyGene PCR儀（杭州朗基公司），Tanon Gis System凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技），Incustar 210型CO2培養(yǎng)箱（BioSource），CKX41倒置相差顯微鏡（Olympus），BX－51熒光顯微鏡（Omachi），ProgRes數(shù)碼照相系統(tǒng)（Jenoptik），Guava easyCyte 8HT流式細(xì)胞儀（Millipore）．

1．2 主要試劑

Trizol試劑（BioBasic），BeyoRT cDNA第一鏈合成試劑盒（RNase H－）（碧云天），Taq DNA聚合酶（上海鼎國），DNA片段純化／回收試劑盒（碧云天），DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、BamH I、PstI及T4DNA連接酶（碧云天），牛小腸堿性磷酸酶（Takara），X－gal及IPTG（碧云天），Plasmid Maxi Kit（QIAGEN），Lipofecter轉(zhuǎn)染試劑（碧云天），重組人干擾素－γ（PeproTech），RPMI－1640培養(yǎng)基（北京賽默飛世爾），新生小牛血清（杭州四季青），胰蛋白酶及雙抗（碧云天）．

1．3 質(zhì)粒、菌種和細(xì)胞系

大腸桿菌DH5α為本室保存，質(zhì)粒pUCm－T購自碧云天公司，pEGFP－C1載體由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供．人喉癌細(xì)胞系Hep－2細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫，貼壁培養(yǎng)于含10%新生小牛血清及1%青、鏈霉素的RPMI－1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2～3d換一次液．

1．4 IFI16基因cDNA合成

培養(yǎng)的人喉癌細(xì)胞系Hep－2細(xì)胞用10ng／mL干擾素－γ處理48h后，消化收集細(xì)胞，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，取2μg總RNA用BeyoRT cDNA第一鏈合成試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取2μL cDNA作為模版用PCR技術(shù)擴(kuò)增IFI16基因編碼區(qū)cDNA．PCR擴(kuò)增引物序列為，上游引物：5－GGCGGATCCATGGGAAAAA－3，下游引物：5－GGCGGATCCCAGATTTTAGAAGAAA－3；PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min后94℃變性35s，54℃退火35s，72℃延伸2min 35s，35個循環(huán)后72℃延伸10 min．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，割膠純化回收目的基因片段，將回收的目的基因連接到pUCm－T載體并進(jìn)行測序，經(jīng)測序正確后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)．

1．5 pEGFP－IFI16真核表達(dá)載體的構(gòu)建

經(jīng)測序正確的目的基因片段用BamH I酶從pUCm－T載體上切出，凝膠電泳純化回收目的IFI16基因片段．同時，用BamH I酶切增強(qiáng)綠色熒光蛋白（EGFP）表達(dá)載體pEGFP－C1，純化回收后再用堿性磷酸酶CIAP處理BamH I酶切的pEGFP－C1載體．隨后，將純化回收的pEGFP－C1載體與純化回收的IFI16基因片段進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌DH5α后涂板培養(yǎng)過夜，第二天挑取若干白色菌落分別培養(yǎng)24h后制備質(zhì)粒DNA，最后，用PstI酶切篩選IFI16基因正向插入的pEGFP－IFI16融合蛋白表達(dá)載體．

1．6 pEGFP－IFI16載體轉(zhuǎn)染Hep－2細(xì)胞

將指數(shù)生長的Hep－2細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種1×104細(xì)胞于0．5mL RPMI－1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h后，用Lipofecter試劑將Plasmid Maxi Kit制備的pEGFP－IFI16載體DNA或pEGFPC1空載體DNA各1μg分別轉(zhuǎn)染導(dǎo)入Hep－2細(xì)胞，每次實(shí)驗(yàn)時每種載體DNA分別轉(zhuǎn)染3個復(fù)孔的細(xì)胞．

1．7 pEGFP－IFI16載體在Hep－2細(xì)胞中表達(dá)檢測

pEGFP－IFI16載體或pEGFP－C1空載體轉(zhuǎn)染Hep－2細(xì)胞48h后，分別消化收集細(xì)胞，然后分別用熒光顯微鏡及半定量RT－PCR技術(shù)分析pEGFP－IFI16載體在Hep－2細(xì)胞中的表達(dá)情況．熒光顯微鏡分析時，細(xì)胞先用1×PBS漂洗2次，然后用488nm激發(fā)波長在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞發(fā)出的綠色熒光信號，并用ProgRes數(shù)碼系統(tǒng)拍攝照片．半定量RT－PCR分析時，先用Trizol試劑分別提取細(xì)胞總RNA，各取2μg總RNA用cDNA合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再各取2μL cDNA作為模板用PCR分析IFI16基因及內(nèi)對照β－actin基因表達(dá)情況．PCR擴(kuò)增IFI16基因時，引物序列為上游引物5’－CCAAGACTGAAGACTGAA－3’，下游引物5’－TAGAAGAAAAAGTCTGGTGAAGTTTCCATACTTG－3’，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性4min后94℃變性30s，50℃退火45s，72℃延伸45s，32個循環(huán)后72℃延伸10min；PCR擴(kuò)增β－actin基因時，引物序列為上游引物5’－GCGGGAAATCGTGCGTGACATT－3’，下游引物5’－GATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTG－3’，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性4min后94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，22個循環(huán)后72℃延伸10min．

1．8 pEGFP－IFI16載體表達(dá)對Hep－2細(xì)胞增殖影響分析

Hep－2細(xì)胞按上述方法接種于24孔培養(yǎng)板后，分別用pEGFP－IFI16載體或pEGFP－C1空載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染或不進(jìn)行轉(zhuǎn)染，從第二天開始，每種轉(zhuǎn)染每天收集3個復(fù)孔細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)每孔細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)值，然后分別求出每種轉(zhuǎn)染每天3個復(fù)孔細(xì)胞計(jì)數(shù)值的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，最后以天數(shù)為橫坐標(biāo)（轉(zhuǎn)染后24h、48h及72h分別命名為day 1、day 2及day 3）、以天數(shù)對應(yīng)的平均值為縱坐標(biāo)，繪出每種轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長曲線．實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次（n＝3），以分析pEGFP－IFI16載體表達(dá)對Hep－2細(xì)胞增殖的影響．

2 結(jié) 果

2．1 pEGFP－IFI16真核表達(dá)載體的構(gòu)建

RT－PCR擴(kuò)增得到一條符合預(yù)期大?。? 190bp）的DNA條帶（圖1），將其純化回收后克隆到pUCm－T載體上，經(jīng)測序證實(shí)該DNA條帶正是我們所需的IFI16基因．隨后，用BamH I酶將IFI16基因從pUCm－T載體上切出，純化回收后，將其克隆到pEGFP－C1載體多克隆位點(diǎn)的BamH I切點(diǎn)上，用PstI酶切篩選IFI16基因的正反向插入，正向插入時PstI酶切得到6 419bp和495bp兩條帶，而反向插入時PstI酶切則得到5 305bp和1 609bp兩條帶，最后篩選得到IFI16基因正向插入的pEGFP－IFI16融合蛋白表達(dá)載體（圖2）．

圖1 RT－PCR擴(kuò)增IFI16基因Fig．1 IFI16gene amplification by RT－PCR

圖2 PstI酶切篩選pEGFP－IFI16重組質(zhì)粒Fig．2 Screening of pEGFP－IFI16recombinant plasmid by PstI digestion

2．2 pEGFP－IFI16載體在Hep－2細(xì)胞中的表達(dá)

pEGFP－IFI16載體轉(zhuǎn)染導(dǎo)入Hep－2細(xì)胞48h后，在熒光顯微鏡下觀察到Hep－2發(fā)出清晰的綠色熒光信號（圖3A），同時，空載體pEGFP－C1轉(zhuǎn)染的Hep－2細(xì)胞也觀察到了清晰的綠色熒光信號（圖3B），并且，空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光信號比pEGFP－IFI16載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光信號要多得多，符合我們的預(yù)期，這是由于空載體比pEGFP－IFI16載體小因而其轉(zhuǎn)染效率高之故，熒光顯微鏡分析結(jié)果說明，pEGFP－IFI16載體在Hep－2細(xì)胞中表達(dá)了EGFP－IFI16融合蛋白．pEGFP－IFI16載體轉(zhuǎn)染導(dǎo)入Hep－2細(xì)胞48h后，半定量RT－PCR分析發(fā)現(xiàn)，Hep－2細(xì)胞IFI16基因mRNA水平要明顯高于空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞及不轉(zhuǎn)染細(xì)胞中IFI16基因的mRNA水平（圖4），半定量RT－PCR分析結(jié)果進(jìn)一步說明，pEGFP－IFI16載體在Hep－2細(xì)胞中表達(dá)了EGFP－IFI16融合蛋白．

圖3 pEGFP－IFI16重組質(zhì)粒在Hep－2細(xì)胞中表達(dá)EGFP－IFI16融合蛋白Fig．3 pEGFP－IFI16recombinant plasmid expressedEGFP－IFI16fusion protein in Hep－2cells

2．3 pEGFP－IFI16載體表達(dá)抑制Hep－2細(xì)胞的增殖

流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)測定細(xì)胞生長曲線顯示，pEGFP－IFI16載體轉(zhuǎn)染后第一天時，Hep－2細(xì)胞其增殖速度與空載體pEGFP－C1轉(zhuǎn)染細(xì)胞及不轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖速度沒有差異，但從第二天起，pEGFP－IFI16載體轉(zhuǎn)染的Hep－2細(xì)胞其增殖速度要慢于空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞及不轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖速度，至第三天時，pEGFP－IFI16載體轉(zhuǎn)染的Hep－2細(xì)胞其增殖速度明顯慢于空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞及不轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖速度（見圖5），統(tǒng)計(jì)分析差異有顯著性（P＜0．05），由此說明，pEGFP－IFI16載體表達(dá)能抑制Hep－2細(xì)胞的增殖．流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)測定細(xì)胞生長曲線結(jié)果說明，IFI16基因?qū)ep－2細(xì)胞增殖起抑制作用．

圖4 半定量RT－PCR分析pEGFP－IFI16重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Hep－2細(xì)胞IFI16基因mRNA水平Fig．4 mRNA level of IFI16gene analyzed by semi－quantitative RT－PCR in Hep－2cells transfected with pEGFP－IFI16recombinant plasmid

圖5 pEGFP－IFI16重組質(zhì)粒表達(dá)抑制Hep－2細(xì)胞的增殖Fig．5 Expression of pEGFP－IFI16recombinant plasmid inhibited the proliferation of Hep－2cells

3 討 論

喉癌發(fā)病率近年來有逐漸上升趨勢，由于傳統(tǒng)喉癌治療手段預(yù)后不理想且有很大毒副作用，因此，揭示喉癌發(fā)病的分子機(jī)制，為臨床開展早期喉癌分子診斷及基因干預(yù)與預(yù)防提供理論基礎(chǔ)顯得尤為重要．

近年來有報(bào)道發(fā)現(xiàn)喉癌的增殖性及預(yù)后好壞與IFI16基因表達(dá)高低有關(guān)［5］；我們的初步研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，IFI16基因可能介導(dǎo)干擾素－γ對喉癌細(xì)胞增殖的抑制作用［4］．IFI16基因是人體內(nèi)的干擾素－γ可誘導(dǎo)表達(dá)基因，它屬于干擾素可誘導(dǎo)的IFI－200（又稱HIN－200）蛋白家族成員，除IFI16基因外，人體內(nèi)還有其它3個成員，分別為MNDA（myeloid nuclear differentiation antigen）基因、AIM2（absent in melanoma 2）基因和IFIX（IFI－inducible protein X）基因．IFI16基因位于人一號染色體1q21－23區(qū)域，研究發(fā)現(xiàn)人一號染色體1q21－23區(qū)域的遺傳改變與某些腫瘤及自身免疫疾病有關(guān)，目前已知IFI16基因是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的易感基因，此外，近年來越來越多的研究報(bào)道IFI16基因在腫瘤中也起作用［6－10］．

本研究通過構(gòu)建IFI16基因的熒光蛋白融合表達(dá)載體，在喉癌細(xì)胞系Hep－2細(xì)胞中表達(dá)IFI16基因的融合蛋白，研究IFI16基因在喉癌細(xì)胞增殖中的作用．首先，利用RT－PCR及基因克隆等技術(shù)，成功將IFI16基因編碼區(qū)cDNA克隆到增強(qiáng)綠色熒光蛋白表達(dá)載體pEGFP－C1中，并利用熒光顯微鏡及半定量RT－PCR技術(shù)分析構(gòu)建載體在Hep－2細(xì)胞中的表達(dá)情況，最后成功構(gòu)建了能在Hep－2細(xì)胞中表達(dá)IFI16基因的熒光融合蛋白的pEGFP－IFI16載體；隨后，將pEGFP－IFI16載體轉(zhuǎn)染導(dǎo)入Hep－2細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)測定細(xì)胞生長曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pEGFP－IFI16載體轉(zhuǎn)染的Hep－2細(xì)胞，從第二天起其增殖速度慢于空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞及不轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖速度，至第三天時pEGFP－IFI16載體轉(zhuǎn)染Hep－2細(xì)胞其增殖速度明顯慢于空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞及不轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖速度，由此說明pEGFP－IFI16載體表達(dá)能抑制Hep－2細(xì)胞的增殖．本研究結(jié)果證明IFI16基因?qū)ep－2細(xì)胞增殖有抑制作用，本研究也為我們的后續(xù)研究打下了一定的研究基礎(chǔ)．

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