王雪梅，王 英，方 強(qiáng)，孫 新，焦玉萌，常雪蓮，夏 惠

豬帶絳蟲的幼蟲囊尾蚴可寄生于人體引起豬囊尾蚴病。豬囊尾蚴病的免疫反應(yīng)十分復(fù)雜，機(jī)體一旦感染豬囊尾蚴，其免疫狀態(tài)就會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，多種免疫細(xì)胞及免疫分子將參與豬囊尾蚴病的免疫調(diào)控。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)是體內(nèi)天然存在的具有獨(dú)特調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞亞群［1］。調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞參與幾乎全部的寄生蟲病免疫反應(yīng)，是寄生蟲感染免疫調(diào)節(jié)的重要環(huán)節(jié)［2-3］。為了了解CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞在豬囊尾蚴病發(fā)病機(jī)制中的作用，我們采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)豬囊尾蚴病患者外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的百分含量，以期進(jìn)一步認(rèn)識(shí)囊尾蚴感染引起的免疫特征，對(duì)闡明豬囊尾蚴病的致病機(jī)制及制定免疫預(yù)防和治療策略將會(huì)有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 標(biāo)本:靜脈血2 ml，肝素抗凝。11 例患者來自蚌醫(yī)附院收治的初診患者，其中男8 例，女3 例，年齡14～40 歲，患者經(jīng)CT 或MRI 以及免疫學(xué)方法確診為豬囊尾蚴病，腦CT 顯示病灶為單發(fā)或多發(fā)的低密度環(huán)形陰影，并排除了合并其他感染、變態(tài)反應(yīng)性及免疫性疾病。正常對(duì)照組:本院健康教職工14 例，其中男4 例，女10 例，年齡24～50 歲，近期無服藥史及感染史。主要試劑:熒光標(biāo)記抗體:抗人CD25-PE(Immunotech，法國(guó))，抗人FOXP3-FITC、抗人CD4-PE-CY5(Caltag，美國(guó));多聚甲醛(PFA)、皂角素(Saponin)為Sigma 公司產(chǎn)品。主要儀器:流式細(xì)胞儀，F(xiàn)ACS Calibur(BD 公司);低溫離心機(jī)(Eppendorf 5810R 型，德國(guó));垂直層流工作臺(tái)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 采用直接熒光標(biāo)記法測(cè)定CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的百分含量，并分析CD4+CD25+T 細(xì)胞中表達(dá)FOXP3 的細(xì)胞比例。取流式染色管2 支，每支加入全血50 μL 后加入2 μL 抗人CD25PE、5 μL 抗人CD4PE-CY5，室溫避光30 min，加溶血素3 ml 室溫避光15 min ，800 g 離心5 min。棄上清，用染色緩沖液(含5%FCS ，0.1% NaN3的PBS)洗2次;加入200 mL 固定劑，室溫避光30 min。取1 mL染色緩沖液800 g 離心5 min。加入500 μL 破膜劑再離心;然后加含有1 μ1 抗FOXP3 FITC 的破膜劑500 μL 后室溫避光1 h。離心后棄上清并洗滌2 次，用200 μL 染色緩沖液重懸上機(jī)檢測(cè)。每份標(biāo)本同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照及熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)管。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

經(jīng)檢測(cè)，囊尾蚴病患者外周血中CD4+CD25+T 淋巴細(xì)胞的百分含量為6.11%，較正常人(3.94%)明顯升高(P＜0.05);患者外周血中CD4+CD25+T 細(xì)胞表達(dá)FOXP3 的細(xì)胞百分含量為15.67%，與正常對(duì)照組(11.09%)有顯著性差異(P＜0.05)，結(jié)果見表1。

表1 患者與對(duì)照組外周血CD4 +CD25 +T 細(xì)胞含量(%，±s)

表1 患者與對(duì)照組外周血CD4 +CD25 +T 細(xì)胞含量(%，±s)

組別例數(shù) CD4 +CD25 +T cellsCD4 +CD25 + FOXP3+豬囊尾蚴病患者116.11 ±2.1415.67 ±6.98正常人143.94 ±1.9811.09 ±3.75 t 值－2.632.11 P 值－＜0.05＜0.05

3 討論

許多病原體在感染過程中都會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制狀態(tài)，這不僅是病原體逃避宿主免疫應(yīng)答的適應(yīng)性機(jī)制，還可以防止機(jī)體在抗感染過程中由于產(chǎn)生過強(qiáng)的免疫應(yīng)答而導(dǎo)致嚴(yán)重的病理?yè)p害［4］。調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞可以控制寄生蟲感染引發(fā)的免疫病理反應(yīng)強(qiáng)度，從而限制對(duì)宿主的損害程度［5］。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞是近年研究較多的一群調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞，己發(fā)現(xiàn)與各種感染性疾病關(guān)系密切。近年來有關(guān)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的免疫作用已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)［6-8］。CD25 也可以在其他活化的T 細(xì)胞表面表達(dá)，并非其特異性標(biāo)志，但有研究表明轉(zhuǎn)錄因了FOXP3 可作為這群調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞最可靠的標(biāo)志［9］。在寄生蟲方面的研究中發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞在抑制對(duì)利什曼原蟲、絲蟲的殺傷作用中發(fā)揮重要作用［10-13］;體內(nèi)抗CD25 單克隆抗體阻斷實(shí)驗(yàn)顯示，移除CD4+CD25+T 細(xì)胞可以保護(hù)易感BALB/c 小鼠對(duì)致死性約氏瘧原蟲的攻擊，該保護(hù)作用與特異性T 細(xì)胞免疫應(yīng)答有關(guān)，提示CD4+CD25+T 細(xì)胞在瘧疾感染過程中可能發(fā)揮免疫抑制作用［14-15］。研究還發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞在血吸蟲卵導(dǎo)致肉芽腫形成中起著重要作用［16］。

本研究對(duì)豬囊尾蚴病患者外周血中CD4+CD25+T 細(xì)胞以及此群體中FOXP3+T 細(xì)胞百分比進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示:CD4+CD25+T 細(xì)胞在豬囊尾蚴病初診患者外周血中比例明顯升高，其中表達(dá)FOXP3 的細(xì)胞群體的比例也明顯升高，這提示CD4+CD25+FOXP3+T 細(xì)胞在豬囊尾蚴感染中可能參與了機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)。下一步擬用患者外周血與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)其抑制功能;同時(shí)準(zhǔn)備用流式細(xì)胞儀檢測(cè)患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞合成Th1/Th2 的影響與變化。只有充分認(rèn)識(shí)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞在豬囊尾蚴感染過程中發(fā)揮的免疫效應(yīng)，特別是闡明其免疫調(diào)節(jié)作用的發(fā)生和調(diào)控機(jī)理，才能會(huì)對(duì)研制和開發(fā)有效的疫苗和設(shè)計(jì)有效的抗感染方案具有重要的科學(xué)意義。

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