張東梅，黃欣，閆春雷，蘇樂群 （．山東大學藥學院，山東 濟南500；．山東省千佛山醫(yī)院，山東 濟南5004）

肝臟疾病是影響人類健康的最為常見的疾病之一，目前對于肝臟疾病的防治仍是一個嚴峻的課題，因此肝損傷動物模型的復制對于肝臟發(fā)病機制研究及護肝藥物的篩選具有重要的現實意義。目前，肝損傷動物模型的復制主要有化學性、免疫性、酒精性、藥物性、生物性等方法，其中生物學方法要求實驗條件高且費用昂貴，多用于病原體及其致病機制的高層次研究；目前科研中較常用的是化學性肝損傷、免疫性肝損傷和酒精性肝損傷模型［1］。本文簡要綜述了建立急、慢性肝損傷動物模型的機制、方法、特點、應用及優(yōu)缺點，以期為肝損傷動物模型的選擇提供參考。

1 化學性肝損傷

1．1 四氯化碳（CCl4） CCl4是經典的復制肝損傷動物模型的化學物質，其肝損傷的機制與CCl4經細胞色素P450代謝產生的三氯甲烷自由基引發(fā)的鏈式過氧化反應有關。三氯甲烷自由基生成后引起膜系統(tǒng)發(fā)生脂質過氧化反應，與肝細胞蛋白或DNA結合破壞肝細胞機能，導致肝細胞損傷壞死。

成年大鼠（Wistar／SD，6～8周齡，雄性多用，下同），一次性腹腔或皮下注射CCl41 mL·kg－1（40%～50%CCl4植物油溶液），24 h左右可形成急性肝損傷模型；采用40%的CCl4植物油溶液按照CCl41 mL·kg－1灌胃或腹腔注射，每周2次，持續(xù)8～12周可形成慢性肝損傷大鼠模型。苯巴比妥、丙酮和酒精等細胞色素P450同工酶化學誘導劑可加強CCl4的肝毒性，縮短CCl4慢性肝損傷的造模時間。

CCl4誘導的肝損傷模型不僅在病理生理方面與人類肝臟疾病的改變相類似，而且重復性好且經濟。但該模型屬于中毒性肝損傷范疇，在免疫病理上與多數肝炎有很大區(qū)別，不適于對有護肝作用的免疫調節(jié)劑或影響免疫系統(tǒng)的護肝藥物評價。另外，CCl4除損害肝組織外，對其他臟器也有損傷，死亡率高。因CCl4揮發(fā)性較大，對實驗人員也有一定的傷害，操作時應注意防護。

1．2D－氨基半乳糖D－氨基半乳糖（D－galactosamine，DGalN）屬于間接肝毒劑，肝損傷機制與其在肝內的代謝及隨后對核苷酸合成的影響有關，其作用機制是：氨基半乳糖與肝細胞內尿苷二磷酸（UDP）結合而形成復合物，使尿苷三磷酸（UTP）耗竭，肝細胞中的RNA和蛋白合成受阻，質膜結構蛋白合成減少，使UDPG尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶－焦磷酸化酶活性和數量均下降，引起糖和磷脂代謝障礙，膜損傷加重，引起肝細胞壞死。肝細胞壞死，細胞外鈣大量內流，引起細胞內鈣穩(wěn)態(tài)破壞，進一步引起代謝紊亂，導致細胞的死亡。另外，氧化應激及炎癥反應在肝損傷的過程中也發(fā)揮了重要作用［2］。

成年大鼠按600～900 mg·kg－1劑量一次性腹腔注射給藥，24～48 h后即可制成急性肝損傷模型［3］。劑量超過1 000 mg·kg－1時，常引起廣泛性肝壞死。

D－GalN所致肝炎的病理生理改變與人類急性病毒性肝炎非常相似，該模型是目前評價病毒性肝炎治療藥物療效的較好模型，但該模型與CCl4肝損傷同屬于中毒性肝損傷范疇，也不適于對有護肝作用的免疫調節(jié)劑或影響免疫系統(tǒng)的護肝藥物評價。氨基半乳糖僅對肝臟有影響，不影響其他器官，但是氨基半乳糖較貴，限制了其廣泛應用。

1．3 α－萘基異硫氰酸酯（α－naphthyl isothiocyanate，ANIT）

ANIT是一種間接肝毒劑，常用于誘導急性肝內膽汁淤積模型。目前認為ANIT引起的肝損傷與谷胱甘肽－ANIT結合物的形成和膽汁排泄有關。ANIT與谷胱甘肽可逆性結合，然后通過小管外排途徑運輸到膽汁，使膽汁內ANIT聚積，損害肝內膽管上皮細胞，引起肝內膽管增生及小葉間膽管周圍炎癥，從而造成膽管阻塞，導致膽汁酸和其他膽汁成分在肝臟中積累，并最終產生肝膽毒性。長期腹腔注射ANIT導致的肝損傷與線粒體功能障礙有關。

將ANIT溶解于橄欖油溶液，成年大鼠按60～100 mg·kg－1劑量灌胃給藥，24～48 h即可形成ANIT急性肝損傷動物模型［4］。采用80 mg·kg－1的劑量腹腔注射，每周1次，持續(xù)16周，可形成慢性肝損傷模型。

ANIT急性肝損傷模型病理學檢查可見以點狀壞死為主的肝實質細胞損害，產生膽汁郁積性黃疸，出現高膽紅素血癥和膽汁分泌減少，用于模擬人類藥物性膽汁淤積和肝損傷。該模型復制簡單易行，重現性好，是篩選保肝利膽藥的理想實驗動物模型。

1．4 二甲基亞硝胺（dimetylnitrosamine，DMN） DMN 是致癌物和誘變劑，具有較強的肝毒性。其肝損傷的機制是：DMN經肝臟CYP2E1代謝活化產生的甲醛和甲醇與核酸和蛋白質發(fā)生烷基化反應，造成細胞內大分子損傷，肝細胞凋亡壞死。肝臟受致病因子侵襲后，基質金屬蛋白酶－2（MMP－2）的表達與活性增高，肝星狀細胞活化，導致細胞增殖及膠原蛋白沉積，促進肝纖維化的形成與發(fā)展。同時激活的MMP－2促進竇內皮細胞形成肝竇毛細血管化，加重肝損傷［5］。

用0．15 mol·L－1NaCl將 DMN稀釋為1%濃度，采用成年大鼠或Balb／c小鼠，按10 mg·kg－1劑量大鼠腹腔注射，每周3次，持續(xù)3～4周可形成肝纖維化動物模型。

DMN誘導的大鼠慢性肝損傷在初期出現膠原蛋白沉積，這是肝纖維化和肝硬化發(fā)病的關鍵。該模型是研究肝纖維化機制、篩選治療肝纖維化藥物的良好動物模型。DMN誘導的大鼠肝纖維化形成率高，且形成后相對穩(wěn)定，但DMN毒性較大，易揮發(fā)，并且排泄物含有毒物，污染環(huán)境。

1．5 硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA） TAA 攝入后，經肝臟混合功能氧化酶系統(tǒng)代謝活化為TAA硫氧化物，繼而代謝產生自由基和活性氧（reactive oxygen species，ROS），它們與細胞內大分子結合，導致細胞脂質過氧化，還原型谷胱甘肽減少，誘導氧化應激。另外細胞內鈣穩(wěn)態(tài)被破壞，細胞內鈣持續(xù)升高。ROS形成增加和鈣穩(wěn)態(tài)的破壞使線粒體內膜滲透性增加，膜電位改變，這些變化激活多個相關的導致細胞損傷或增殖的機制，從而促進肝纖維化肝硬化的發(fā)展。

成年大鼠采用400 mg·kg－1的劑量腹腔注射TAA，12～24 h后即造成大鼠急性肝衰竭模型；采用200 mg·kg－1劑量腹腔注射，每周3次，持續(xù)8周可形成典型的肝纖維化模型［6］；采用含 TAA300 mg·L－1（約為25 mg·kg－1·d－1）的飲水喂養(yǎng)3～4個月可誘導大鼠形成肝硬化模型。

TAA誘發(fā)的肝纖維化與人肝纖維化的生化病理變化相似，并且死亡率低、成功率高，形成的肝纖維化相對穩(wěn)定不易逆轉，是經典的肝纖維化模型之一，適用于肝纖維化機制的研究與治療藥物的篩選評價等。

2 免疫性肝損傷

2．1 刀豆蛋白A（Con A） Con A誘導的肝損傷模型是由T細胞介導的，依賴于CD4＋T細胞和巨噬細胞之間相互作用，通過淋巴細胞、單核細胞以及肝臟中的Kupffer細胞參與的炎癥反應造成肝損傷。在此過程中細胞因子TNF－α、IFN－γ、IL－6等在細胞增殖及凋亡和壞死中起重要作用［7］。

6～8周齡雄性Balb／c小鼠一次性尾靜脈注射ConA15～20 mg·kg－1，12 h可形成急性免疫性肝損傷模型［8］；尾靜脈注射ConA10 mg·kg－1，每周1次，持續(xù)8周，可形成慢性免疫性肝損傷模型［9］。

ConA誘導的肝損傷模型是由T淋巴細胞介導的，較好地模擬人類病毒性肝炎引發(fā)的免疫性肝損傷的病理生理過程。ConA所致的肝損傷具有劑量依賴性和器官特異性，制作簡單無需預先致敏。該模型與人類病毒性肝炎相比，不存在病毒復制和肝實質持續(xù)損傷的過程，僅有利于從免疫學角度探討發(fā)病機制和評價藥物療效。

2．2 BCG聯合細菌脂多糖（LPS） LPS是一種內毒素，可誘發(fā)預先接種卡介苗（BCG）的小鼠形成急性肝損傷模型。BCG聯合LPS誘導的肝損傷，其損傷機制是以細胞免疫為主的變態(tài)反應，BCG首先激活致敏T淋巴細胞，尤其是致敏肝內Kupffer細胞和巨噬細胞，當注射LPS后進一步激活致敏的Kuppfer細胞和巨噬細胞，使其釋放大量的細胞毒因子，如腫瘤壞死因子、一氧化氮、白細胞介素、自由基、白三烯等造成肝細胞損害。

采用6～8周齡雄性昆明小鼠或C57BL／6小鼠，首先尾靜脈注射含5×106－7個活菌的BCG生理鹽水溶液，致敏T淋巴細胞。10 d后，尾靜脈注射含7．5～10μg LPS的脂多糖生理鹽水，16 h后形成免疫性肝炎模型［10］。

BCG聯合LPS誘導的肝損傷模型的病理過程，與人類肝炎中Kupffer細胞等非特異性免疫細胞在肝細胞內浸潤并釋放大量細胞因子造成的肝細胞損害的病理過程相似。該模型為臨床研究病毒性肝炎發(fā)病機制以及從免疫途徑篩選護肝藥物提供了良好的動物模型，并且造模時間短，方法簡便易行。但該模型制作過程中需用BCG預先致敏，BCG批號不同，活性可能存在差別，所以實驗前需對BCG用量進行摸索調整。另外也可用滅活的短小棒狀桿菌或痤瘡丙酸桿菌預先致敏。

2．3D－GalN聯合LPSD－GalN可耗竭肝細胞內 UTP，抑制RNA合成；促使肥大細胞脫顆粒，釋放組胺，引發(fā)結腸水腫，增強機體對LPS的敏感性。LPS活化Kupffer細胞和巨噬細胞合成和分泌TNF－α及其他炎性細胞因子，使D－GalN致敏小鼠發(fā)生的肝細胞凋亡和壞死；此外氧自由基產生的氧化應激也是一種重要的損傷因素。最近研究表明，在DGalN聯合LPS介導的急性肝衰竭與JNK的持續(xù)性活化有關［11］，因為JNK的持續(xù)的活化會導致細胞凋亡的發(fā)生。

6～8周齡雄性Balb／c小鼠，按D－GalN300～700 mg·kg－1和LPS50～10μg·kg－1的劑量腹腔注射，16 h后可形成小鼠免疫性急性肝損傷模型。

D－GalN聯合LPS誘導的肝損傷模型被認為是內毒素引起肝損傷的良好模型，在內毒素性肝損傷的損傷機制研究及相關藥物的篩選評價中具有重要意義，但在制作過程中需要預先致敏。

3 藥物性肝損傷

3．1 對乙酰氨基酚（AP） AP的肝毒性與其在肝內的代謝有關。通常情況下，AP主要在肝內與硫酸鹽和葡糖苷酸結合，只有少量被CYP2E1酶降解為高毒性的活性代謝物N－乙酰－對－苯醌亞胺（NAPQI），NAPQI與線粒體內還原型谷胱甘肽（GSH）結合后解毒。當AP劑量過大時（超過12～15 g），其代謝過程中產生的大量NAPQI超過了GSH的解毒能力，未被清除的NAPQI與細胞和線粒體蛋白質結合，影響它們的功能并最終導致細胞壞死。

將AP加熱溶于生理鹽水，按300～500 mg·kg－1劑量給6～8周齡雄性Balb／c小鼠一次性腹腔注射，也可用2．5%的AP混懸液灌胃給藥，24 h后可形成急性肝損傷模型。

AP誘導的急性肝損傷模型出血和脂肪變性不明顯，形態(tài)學主要表現為以中央靜脈為中心的圓盤狀大量細胞壞死，多用于因各種原因導致谷胱甘肽含量減少而引起肝細胞損傷的治療藥物篩選。AP誘導的肝損傷對小鼠十分敏感而對大鼠不敏感。

3．2 異煙肼聯合利福平 異煙肼和利福平兩藥聯用是目前結核病短程療法的治療方式，但兩藥聯用肝毒性明顯增加，其機制是：異煙肼在肝臟中經過CYP450代謝為乙酰肼及肼，肼與巰基反應導致肝內的GSH耗竭而引起細胞膜及線粒體膜的脂質過氧化，線粒體膜通透性改變，肝細胞損傷。而利福平在肝臟中去乙?；?，為異煙肼乙?；峁┮阴；?，且利福平誘導CYP450酶，使異煙肼代謝加快，乙酰肼代謝的活性中間體及肼的量相繼增加，導致肝毒性明顯增加。

成年大鼠灌胃或腹腔注射異煙肼50～100 mg·（kg·d）－1，利福平50～100 mg·（kg·d）－1，持續(xù)3～4周，可形成大鼠肝損傷模型［12］。

異煙肼聯合利福平建立的大鼠肝損傷模型，病理學檢查可見肝細胞腫脹、淤血，羽毛狀變性，小葉中心區(qū)域出現炎癥［13］。該模型為深入研究人類異煙肼利福平聯用導致肝損傷的發(fā)病機制提供較好的動物模型。

4 酒精性肝病

目前酒精對肝損傷的機制尚未完全闡明，認為其發(fā)病機制與氧化應激、線粒體功能損傷、內質網應激和免疫／炎癥反應等多種因素有關［14］。首先，乙醇在肝臟中的毒性代謝產物乙醛能誘導肝臟氧化應激，使線粒體和微管系統(tǒng)受損。乙醇經過微粒體乙醇氧化系統(tǒng)中CYP 2E1代謝產生ROS，導致氧化損傷；其次，長期乙醇暴露會損傷線粒體功能，導致生物能量減少，ROS產生增加，GSH減少，線粒體DNA損傷和蛋白質合成抑制，線粒體通透性敏感性增加，通過壞死和細胞凋亡途徑引起肝損傷；另外長期大量飲酒可激活肝臟的Kupffer細胞產生大量核轉錄因子－κB（nuclear factor－κB，NF－κB），NF－κB促進活化的肝臟Kupffer細胞產生產生大量的炎癥因子 TNF－α、IL－1等［15］，從而引起肝細胞脂肪變性、炎癥、壞死，同時刺激肝細胞增生，抑制膠原酶活性，促進肝纖維的形成。

成年大鼠或小鼠以50～60度白酒一次性灌胃或腹腔注射4～6 g·kg－1，4～24 h可形成急性酒精性肝損傷模型［16］。大鼠按照15 mL·kg－1的劑量灌胃50～60度的白酒，每天1次，12周可形成慢性酒精性肝損傷模型。另有一些學者采用梯度濃度酒精，分次少量灌胃的方法，對制作大鼠慢性酒精性肝損傷模型的方法進行了改進。

慢性酒精性肝損傷模型病理學檢查可見肝細胞脂肪變性，壞死嚴重，炎癥細胞浸潤。一些壞死區(qū)可見明顯的纖維細胞增生，相鄰肝小葉中央靜脈之間或相鄰匯管區(qū)之間出現橋接壞死。該模型與人類酒精性肝病病變相似，穩(wěn)定可靠，對于人類酒精性肝病的發(fā)病機制的研究以及保肝藥物的篩選具有重要意義。缺點是造模時間長，頻繁灌胃較為繁瑣且操作不當可造成動物窒息死亡。

5 缺血再灌注損傷（IR）

IR是指缺血器官、組織重新獲得血液供應，不僅不能使組織、器官功能恢復，反而加重了功能代謝障礙及結構破壞。研究發(fā)現微循環(huán)障礙、氧自由基過多、鈣超載、Kuffer細胞活化及細胞凋亡等是引起肝臟缺血再灌注損傷的重要機制。首先肝細胞因缺血、缺氧使ATP生成減少，鈣離子進入細胞增多，使細胞膜以及線粒體功能受損。當再灌注時，氧氣增多，生成大量的自由基，而此時線粒體功能受損，對氧自由基的清除能力不足，導致氧自由基增多，損傷膜系統(tǒng)、蛋白質、核酸及細胞外基質，從而進一步加重細胞的凋亡。另外多種細胞因子和促炎性因子也參與了肝臟缺血再灌注損傷的病理生理過程。

肝臟缺血再灌注損傷是影響移植肝存活率的一個重要因素。該模型可用于再灌注損傷的發(fā)病機制研究，缺血后處理以及藥物后處理的研究探索，對于減輕及預防缺血再灌注損傷和改善預后，具有十分重要的意義。

綜上所述，目前肝損傷模型的造模方法很多，根據研究目的，選擇特定有針對性的肝損傷動物模型非常必要，但由于影響肝功能的因素多，且造成肝損傷的機制復雜，無論哪種實驗性模型都存在缺陷，都不能全面、準確地反映人類特定肝損傷的本質。相信隨著對肝臟疾病研究的深入，相應的肝損傷動物模型將不斷地完善；同時，肝損傷動物模型的完善也將推動著肝臟疾病研究的向前發(fā)展。

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