余 翔

（荊州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，湖北 荊州 434000）

梔子色素產(chǎn)業(yè)的發(fā)展在中國(guó)始于20世紀(jì)80年代初，率先在該領(lǐng)域進(jìn)行開(kāi)發(fā)研究的單位有：清華大學(xué)、武漢市一輕工業(yè)科學(xué)研究所及湖北生物制品廠等。通過(guò)30 余年的努力，中國(guó)在該產(chǎn)業(yè)雖然已具備了資源、產(chǎn)能、市場(chǎng)三大優(yōu)勢(shì)，但與發(fā)達(dá)國(guó)家相比，在技術(shù)創(chuàng)新和產(chǎn)品質(zhì)量等方面仍存在很大差距。

梔子色素的產(chǎn)品較多，但只有3種產(chǎn)品處于主導(dǎo)地位，分別為梔子藍(lán)、梔子甙和梔子黃?？蒲腥藛T研究了呈色機(jī)理［1］、轉(zhuǎn)色酶［2］、原料純度［3］等因素對(duì)梔子藍(lán)質(zhì)量的影響，付向陽(yáng)［4］、劉成倫［5］等也發(fā)表了相關(guān)的研究報(bào)告。關(guān)于梔子甙的提取分離工藝國(guó)內(nèi)已有報(bào)道［6，7］，結(jié)晶梔子甙工業(yè)化中試也取得成功［3］，但梔子甙產(chǎn)品價(jià)格偏高，降低成本成為拓寬梔子甙國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的關(guān)鍵。國(guó)內(nèi)學(xué)者針對(duì)梔子黃雜質(zhì)的去除開(kāi)展了大量的研究，陸偉［8］、王丕川［9］等采用不同樹(shù)脂精制梔子黃；趙宜江［10］、陳順偉［11］等分別采用陶瓷膜、PS－1膜提純梔子黃色素；張德權(quán)等［12］采用超臨界萃取法純化梔子黃色素；涂華等［13］采用微波輔助提取與大孔樹(shù)脂純化梔子黃色素。目前，中國(guó)國(guó)內(nèi)高端梔子黃產(chǎn)品尚未面市，而日本已在梔子黃的標(biāo)準(zhǔn)中增加了梔子甙這一指標(biāo)［14］，如果此標(biāo)準(zhǔn)為聯(lián)合國(guó)JECFA 認(rèn)可，中國(guó)梔子黃的出口貿(mào)易可能會(huì)遭遇新的挑戰(zhàn)。因此，本試驗(yàn)對(duì)3種梔子色素產(chǎn)品的關(guān)鍵工藝技術(shù)進(jìn)行了較深入探討，以期把中國(guó)在梔子色素產(chǎn)品資源、產(chǎn)能方面的優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)化為經(jīng)濟(jì)效益。

1． 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

β－葡苷酶HW126、93%梔子甙：武漢市一輕工業(yè)科學(xué)研究所；

梔子藍(lán)AU：日本臺(tái)糖株式會(huì)社；

膠原蛋白肽：湖北瑞邦生物科技有限公司；

水：重蒸水，本實(shí)驗(yàn)室自制；

乙腈、甲醇：色譜純，美國(guó)Anaqua Chemicais Supply公司。

1．2 試驗(yàn)儀器

水純化系統(tǒng)：Milli－Q Integral型，美國(guó)Millipore公司；

雙光束紫外分光光度計(jì)：UV2501型，日本島津株式會(huì)社；

高效液相色譜儀：Alliance HPLC型，美國(guó)Waters公司。

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 色素液λmax的測(cè)定 將酶法轉(zhuǎn)色的色素液濾清，稀釋500倍，用1cm 比色皿在UV2501上掃描，即可得出最大吸收峰λmax的波長(zhǎng)數(shù)。

1．3．2 梔子甙的HPLC 檢測(cè) 以水－乙腈－甲醇為流動(dòng)相，色譜柱為Hypersil ODS，流速1．2 mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)238nm。

1．3．3 梔子黃的檢測(cè) 準(zhǔn)確稱(chēng)樣0．5g，用pH ＝3．5 的檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖液定容至100 mL，取此液1 mL，再用緩沖液稀釋至100mL，使用1cm 比色血，在波長(zhǎng)440nm處，測(cè)定稀釋液的吸光度A。

再按式（1）計(jì)算總色價(jià)：

式中

E—— 總色價(jià)；

A—— 稀釋液的吸光度；

f—— 稀釋倍數(shù)；

m1—— 樣品重量，g。

1．3．4 比值法判斷梔子黃純度 梔子甙G 的吸光度／梔子黃C的吸光度（G／C），綠原酸Ch 的吸光度／梔子黃C的吸光度（Ch／C），其中G 為梔子甙在238nm 處的吸光度，Ch 為綠原酸在328nm 處的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2．1 梔子藍(lán)的關(guān)鍵工藝技術(shù)研究

梔子藍(lán)不是植物中的天然組分，而是以梔子中的梔子甙為底物，通過(guò)生化反應(yīng)（酶促反應(yīng)）或發(fā)酵方法而取得的產(chǎn)品，屬于生物轉(zhuǎn)化類(lèi)的天然色素。按梔子藍(lán)的藍(lán)色純度及飽和度，可將產(chǎn)品分為三類(lèi)：低端產(chǎn)品，λmax≤590nm，藍(lán)中帶紫；中端產(chǎn)品，590nm ＜λmax≤600nm，藍(lán)色純正，但飽和度不足；高端產(chǎn)品，λmax＞600nm，且在pH ＝3、乙醇含量≥50% 的條件下，不產(chǎn)生混濁和沉淀。從目前中國(guó)國(guó)產(chǎn)產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，λmax均在595nm 附近，且在pH＝3、乙醇含量35%的條件下，很快產(chǎn)生沉淀，均只屬于中端產(chǎn)品。

生產(chǎn)梔子藍(lán)的生化反應(yīng)涉及諸多影響因素，如底物濃度、水解酶濃度、酶的特異性及親和力、酶的最適反應(yīng)條件、生成物的反饋抑制、反應(yīng)系統(tǒng)的溫度、pH 值、酶的激活劑和抑制劑的含量、氧化還原電位等［15］。

本試驗(yàn)選用活力高、親和力強(qiáng)的β－葡苷酶、脫色純化的多肽或氨基酸及氯原酸、梔子黃含量盡可能低且純度≥90%的梔子甙；在反應(yīng)溫度50 ℃、pH 5．0～5．5 條件下進(jìn)行酶解，減少了雜質(zhì)氮源的影響，有效降低了生產(chǎn)成本。使用島津UV－2501檢測(cè)了新型梔子藍(lán)產(chǎn)品的UV 圖譜，其主峰λmax為608nm、次峰λmax為653nm（圖1），主峰λmax決定了藍(lán)色的基調(diào)，而次峰λmax及峰高則決定了藍(lán)色的飽和度和亮度。并與臺(tái)糖株式會(huì)社生產(chǎn)的梔子藍(lán)產(chǎn)品進(jìn)行了對(duì)比，臺(tái)糖梔子藍(lán)樣品的主峰λmax為600nm、次峰λmax為653nm（圖2）。總體來(lái)看，兩者峰型基本一致，說(shuō)明兩種梔子藍(lán)的結(jié)構(gòu)、組成相似；而從主峰λmax、次峰的峰高值來(lái)看，本研究研制的新型梔子藍(lán)產(chǎn)品的質(zhì)量更勝一籌。

圖1 本試驗(yàn)研制的新型梔子藍(lán)的UV 圖譜Figure1 UV graph of our new gardenia blue

圖2日本臺(tái)糖株式會(huì)社梔子藍(lán)UV 圖譜Figure2 UV graph of gardenia blue from the Japan Taiwan Sugar Corporation

2．2 梔子甙的關(guān)鍵工藝技術(shù)

梔子甙既是梔子中的有效藥用成分，又是生產(chǎn)梔子藍(lán)、梔子紅的原料。研究［16，17］表明，梔子甙具有顯著的抗病毒、抗腫瘤、抗內(nèi)毒素作用，能有效地治療苯并芘引起的皮膚癌、HSV 引起的唇癌、HSV－II或HPV 引起的宮頸癌和病因尚未明確的惡性黑素瘤，極有可能開(kāi)發(fā)成為國(guó)家一類(lèi)新藥。按外觀形態(tài)可將梔子甙分為粉末和結(jié)晶梔子甙；按純度可將梔子甙分為3類(lèi)：純度＜90%為低端產(chǎn)品；90%≤純度＜98%為中端產(chǎn)品，也稱(chēng)為梔子單體；純度≥98%為高端產(chǎn)品也稱(chēng)為純品。

在技術(shù)上，目前通用的色譜法、結(jié)晶法、吸附法都能獲得很好的梔子甙單體和純品［18］。但如果采用外購(gòu)單體梔子甙作為生產(chǎn)高品質(zhì)梔子藍(lán)、梔子紅的原料，通常生產(chǎn)廠家已無(wú)利潤(rùn)空間，要拓寬梔子甙的國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)必須以低碳、低耗、高效為目標(biāo)開(kāi)展關(guān)鍵工藝的創(chuàng)新與優(yōu)化。

本研究對(duì)高速逆流色譜（HSCCC）、高效液相色譜（HPLC）、吸附解析、柱層析等方法進(jìn)行了比較研究，確定了多元溶劑系統(tǒng)純化工藝，所生產(chǎn)的單體梔子甙含量穩(wěn)定在92%以上、梔子甙純品含量穩(wěn)定在98%以上（圖3）；從生產(chǎn)成本上看，單體梔子甙僅為原工藝的50%、純品梔子甙僅為原工藝的10%（表1）。

圖3 純品梔子甙的HPLC圖譜Figure3 HPLC graph of pure geniposide produced by the new processing technique

表1 4種工藝的技術(shù)經(jīng)濟(jì)參數(shù)比較Table1 Technical and economic parameters of four processing techniques

2．3 梔子黃的關(guān)鍵工藝技術(shù)

梔子黃是梔子系列色素中最早面市的產(chǎn)品，由于它并非單一成分，所以不能用HPLC外標(biāo)法進(jìn)行定量檢測(cè)。國(guó)際上通用的辦法是色價(jià)法和比值法并用，即用色價(jià)法判斷梔子黃含量的高低，而用比值表示特定雜質(zhì)的相對(duì)含量。常用的吸光度A 的比值有兩個(gè)：G／C 和Ch／C（參見(jiàn)1．2）。當(dāng)兩者的比值均大于0．4時(shí)，雜質(zhì)含量較高，為低端產(chǎn)品；當(dāng)兩者的比值在0．2和0．4之間時(shí)，為中端產(chǎn)品；當(dāng)兩者的比值都小于0．2時(shí)，雜質(zhì)含量很低，則為高端產(chǎn)品［19］。

本研究開(kāi)發(fā)出一種精確分離梔子黃雜質(zhì)的工作系統(tǒng)，可穩(wěn)定地將中端梔子黃精制成高端梔子黃。經(jīng)測(cè)定，Ch／C ＝00?．．17 10 03＝0．158＜0．2；G／C＝0 0?．．17 20 33＝0．175＜0．2（圖4）。

3 結(jié)論

本研究提出了λmax＞600nm 和通過(guò)次峰提高梔子藍(lán)藍(lán)色飽和度和亮度及大幅降低梔子甙生產(chǎn)成本、精細(xì)分離梔子黃雜質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)，雖然這些技術(shù)已經(jīng)取得了突破性進(jìn)展，但是離工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)還有較大的距離。

圖4 精制梔子黃的UV 圖譜Figure4 UV graph of gardenia yellow refined by FIT

1 吳拾荊，張繼川，張平安，等．梔子藍(lán)的呈色機(jī)理及提高產(chǎn)品質(zhì)量的途徑［J］．中國(guó)食品添加劑，1992（3）：90～92．

2 吳拾荊，李華．β－葡苷酶高產(chǎn)株的篩選及應(yīng)用［J］．武漢化工學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，23（2）：28～30．

3 余翔，王宇航，李華，等．結(jié)晶梔子甙工業(yè)化中試產(chǎn)品穩(wěn)定性研究［J］．中國(guó)食品添加劑，2011（2）：115～120．

4 付向陽(yáng)，李世杰，方尚玲．桿菌發(fā)酵梔子黃廢液產(chǎn)梔子藍(lán)色素的搖瓶發(fā)酵優(yōu)化［J］．中國(guó)食品添加劑，2002（2）：33～36．

5 劉成倫，徐龍君，謝上芬．從梔子黃廢液中提制天藍(lán)色色素［J］．精細(xì)化工，1995（12）：50～52．

6 劉成倫，徐龍君，謝上芬．從梔子黃廢液中分離京尼平苷［J］．渝川大學(xué)報(bào)，1995（12）：51～53．

7 張慶華，李世杰，錢(qián)衛(wèi)國(guó)，等．從梔子黃廢液中提取梔子甙的工藝研究［J］．化學(xué)與生物工藝，2005（9）：31～34．

8 陸偉，錢(qián)驊，張衛(wèi)明，等．梔子黃色素的提取及精制研究［J］．中國(guó)食品添加劑，2010（1）：77～80．

9 王丕川，華建炳，王良華，等．NKA 大孔吸附樹(shù)脂分離梔子黃［J］．化工進(jìn)展，2003，22（6）：622～625．

10 趙宜江，姚建民，徐南平，等．無(wú)機(jī)膜提取梔子黃色素的工藝研究［J］．南京化工大學(xué)學(xué)報(bào)，1997（3）：16～21．

11 陳順偉，江建明．超濾法梔子黃精制和濃縮研究［J］．浙江林業(yè)科技，1993（3）：16～21．

12 張德權(quán)，呂飛杰，徐南平，等．超臨界CO2流體技術(shù)精制梔子黃研究［J］．農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，1994（4）：226～230．

13 涂華，陳碧瓊，周錫蘭．梔子黃色素的提取及純化工藝的優(yōu)化［J］．貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（7）：192～194．

14 中日兩國(guó)食用著色劑標(biāo)準(zhǔn)研討會(huì)紀(jì)要［J］．中國(guó)食品添加劑，2005（2）：135．

15 楊志，張芳，李梅，等．梔子藍(lán)色素制備及純化工藝的研究［J］，河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，29（2）：59～63．

16 郭曙軍，趙志英．梔子苷的藥理作用及其作用機(jī)制研究進(jìn)展［J］．包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，29（2）：111～113．

17 伏建峰，趙華，史清海，等．梔子苷拮抗內(nèi)毒素的實(shí)驗(yàn)研究［J］．中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2013，30（4）：352～356．

18 任治軍，張立明，何開(kāi)澤．梔子主要成分的提取工藝及藥理研究進(jìn)展［J］．天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2005，17（6）：831～836．

19 曾凡逵，李?lèi)?ài)軍，黃雪松．梔子黃色素的研究現(xiàn)狀［J］．中國(guó)食品添加劑，2006（2）：110～113．