楊慧敏 周文化 李維敏 趙登登

（1．稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004；2．中南林業(yè)科技大學(xué)食品學(xué)院，湖南 長沙 410004；3．廣州市艾可生物科技有限公司，廣東 廣州 516898）

椰子水（coconut water）是存在于椰子（Cocos nucifera L．）果實(shí)腔內(nèi)的一種天然果汁，是椰子果在發(fā)育成熟過程中形成果肉的物質(zhì)基礎(chǔ)，富含多種營養(yǎng)素［1］。研究［2］表明，椰子水含有人體所需的17種氨基酸，必需氨基酸種類齊全，營養(yǎng)豐富；椰子水蛋白質(zhì)中的精氨酸、丙氨酸、胱氨酸和絲氨酸的含量比牛奶還高。而且椰子水還具有醫(yī)藥價(jià)值，可以治療胃功能紊亂、痢疾和兒童營養(yǎng)不良，具有解毒、抗菌消炎、駐顏美容、促消化和利尿等功能，對(duì)腎結(jié)石和尿道結(jié)石有一定療效，還具有明目健胃醒酒和降壓止血的功效［3，4］，是一種營養(yǎng)和保健價(jià)值很高的天然飲料。

氨基酸是果實(shí)品質(zhì)的組成成分之一，并參與果實(shí)其他品質(zhì)特征成分和風(fēng)味物質(zhì)合成［5］，其含量的高低是評(píng)價(jià)椰子水營養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)。不同成熟度和新鮮度的椰子水，氨基酸的組分和含量會(huì)有很大的差別，因此所具有的營養(yǎng)價(jià)值也就不同了。國內(nèi)外對(duì)椰子水中氨基酸的含量分析研究甚少，而且對(duì)氨基酸方法和種類的研究手段和覆蓋面也不多。因此，椰子水及其飲料中氨基酸組分的準(zhǔn)確定性定量分析，對(duì)于正確評(píng)價(jià)椰子水及其飲料品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值具有重要意義。以往氨基酸的分析測(cè)定方法主要集中在柱前和柱后衍生－反相高效液相色譜法研究［6－10］，這些傳統(tǒng)的測(cè)定氨基酸的方法，均存在操作復(fù)雜、不穩(wěn)定、精密度和重現(xiàn)性較差、分離效果不好、靈敏度不高的缺點(diǎn)。目前氨基酸的測(cè)定也同時(shí)應(yīng)用氨基酸自動(dòng)分析儀法［11－14］，氨基酸分析儀是為氨基酸分析而設(shè)計(jì)，它配制有專用的陽離子樹脂氨基酸分離柱以及專用的檢測(cè)器和符合國標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法，可以直接測(cè)定樣品中各種游離氨基酸含量，除去脂肪雜質(zhì)后直接上柱分析。其操作簡便，分辨程度高，選擇性強(qiáng)、分離度高、穩(wěn)定性好，但在椰子水及其飲料中的應(yīng)用尚未見報(bào)道。本研究采用氨基酸自動(dòng)分析儀法檢測(cè)不同成熟度椰子（椰青、嫩椰子、成熟椰子）中椰子水及其椰子水飲料的氨基酸組成和含量，并進(jìn)行比較分析。

1 材料與方法

1．1 材料

供試驗(yàn)的椰子為海南文昌椰子品種，在不同成熟期采集椰子果實(shí)樣本（椰青、嫩椰子、成熟椰子。根據(jù)成熟度的不同確定的，三成成熟度綠色皮的是椰青、六成成熟度的是嫩椰子、九成成熟的是成熟椰子），以及（以嫩椰子為原料，通過試驗(yàn)調(diào)配，即椰子汁與水質(zhì)量比為2∶1，糖度5%，pH 4．6，殺菌條件為100 ℃／15 min，制備得到的）天然椰子水飲料，分別用于實(shí)驗(yàn)室分析椰子水及飲料中氨基酸的含量。

1．2 主要儀器與試劑

全自動(dòng)氨基酸分析儀：L－8900型，日本Hitachi公司；

氨基酸分析專用離子交換柱：No．2622型，日本Hitachi公司；

電子天平：AL－204型，天津市天馬儀器廠；

恒溫干燥箱：SPX－250C型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)廠；

混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液（含17種氨基酸，包括天冬氨酸，蘇氨酸，絲氨酸，谷氨酸，甘氨酸，丙氨酸，胱氨酸，纈氨酸，蛋氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，賴氨酸，組氨酸，精氨酸，脯氨酸）：化學(xué)純，日本和光純藥工業(yè)公司；

茚三酮衍生試劑成套、醋酸鋰、冰醋酸、硼氫化鈉、流動(dòng)相：分析純，日本和光純藥工業(yè)公司；

鹽酸：分析純，中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司。

1．3 方法

1．3．1 分析條件 氨基酸自動(dòng)分析儀是采用柱后茚三酮離子交換色譜法，磺酸型陽離子樹脂分離柱規(guī)格：4．6 mm×50mm，3μm；柱溫：＜135 ℃；泵流速0～0．999mL／min；泵壓力0～20kPa；分析時(shí)間約30 min；進(jìn)樣量20μL；雙波長檢測(cè)，440nm 處檢測(cè)脯氨酸，570nm 處檢測(cè)其它氨基酸；對(duì)100pmol以上的氨基酸進(jìn)行準(zhǔn)確分析［15］。

1．3．2 緩沖液的配制 使用自配緩沖液，各氨基酸的分離度較好，能夠較長時(shí)間保持穩(wěn)定，定量分析準(zhǔn)確，具體見表1。

所有試劑配制完成后需置于超聲波清洗器清洗15min，以使溶質(zhì)充分溶解使試劑清亮透明，后經(jīng)真空泵微孔濾膜過濾除去大部分雜質(zhì)和微細(xì)顆粒，避免堵塞分離柱。配好的緩沖 液 置 于4 ℃冰 箱 保 存［16］。

1．4 樣品測(cè)定

1．4．1 樣品預(yù)處理

（1）樣品蛋白質(zhì)水解采用酸水解的方法：精密稱取混合均勻的4個(gè)液體樣品3．000～4．000g（使試樣蛋白質(zhì)含量在10～20mg范圍內(nèi)），置于水解管中（注意不要?dú)埩粼诠鼙谏希?，等體積加入濃鹽酸3～4 mL，再補(bǔ)加6 mol／L 鹽酸至10mL，將水解管抽真空10min后用酒精噴燈封口。將水解管置于（110±1）℃的恒溫干燥箱內(nèi)水解22h后，取出冷卻至室溫，水解過程中取出輕輕振搖2～3次，以洗下粘在管壁上的樣品。打開水解管，將水解液全部轉(zhuǎn)入50 mL 容量瓶中，用去離子水定容。過濾并棄去初濾液，取1mL濾液于小燒杯中，在40～50 ℃的真空干燥箱中烘干。殘留物用0．02mol／L的鹽酸溶液洗下并定容至2 mL，過濾膜后得到4個(gè)樣品，最后上機(jī)采用L－8900氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定。

表1 緩沖液的配置Table1 Configuration of the buffer

（2）具體取樣量：椰青椰子水3．609 g，嫩椰子水3．456g，成熟椰子水3．599g，椰子水飲料3．604g。

1．4．2 總氨基酸的定性及定量測(cè)定 根據(jù)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和光譜圖對(duì)樣品中氨基酸進(jìn)行定性分析，用色譜工作站測(cè)定，依據(jù)外標(biāo)曲線計(jì)算氨基酸的含量（mg／100g），試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SAS9．0軟件進(jìn)行分析。結(jié)果計(jì)算公式見式（1）：

式中：

X—— 樣品中氨基酸含量，g／100g；

C——20μL試樣測(cè)定液中氨基酸的含量，nmol；

F—— 稀釋倍數(shù)；

V—— 水解后定容體積，mL；

M—— 氨基酸分子量；

m—— 試樣稱樣量，g；

20—— 進(jìn)樣體積，μL；

106—— 換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2．1 混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜分離

按照上述分析條件，17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜分離見圖1，所有衍生物均可獲得較好的分離。

2．2 椰子水中及其飲料中氨基酸圖譜及檢測(cè)結(jié)果

2．2．1 氨基酸衍生物的色譜圖 不同成熟度椰子水氨基酸的色譜圖見圖2～5。

圖1 17種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸色譜圖Figure1 The chromatograms of 17species of normal amino acids

圖2 椰青椰子水中氨基酸衍生物的色譜圖Figure2 The chromatogram of amino acids of young coconut water

圖3 嫩椰子椰子水中氨基酸衍生物的色譜圖Figure3 The chromatogram of amino acids of tender coconut water

由圖2～5可知，每種椰子水和椰子水飲料的所有氨基酸衍生物均獲得較好分離。共檢測(cè)到17種氨基酸，其中必需氨基酸有7種（除成熟椰子水）。根據(jù)17種氨基酸圖譜峰值的結(jié)果可知，椰青、嫩椰子、成熟椰子和椰子水飲料中含量最高的氨基酸是谷氨酸，其次是丙氨酸和天冬氨酸。

圖4 成熟椰子水中氨基酸衍生物的色譜圖Figure4 The chromatogram of amino acids of mature coconut water

圖5 椰子水飲料氨基酸衍生物的色譜圖Figure5 The chromatogram of amino acids of coconut water beverage

2．2．2 氨基酸含量檢測(cè)結(jié)果 由表2可知，不同成熟度椰子水和椰子水飲料中氨基酸的含量均有差異?？偘被岷恳来螢槟垡铀⒁嘁铀?、成熟椰子水、椰子水飲料。其中，谷氨酸、丙氨酸和天冬氨酸含量均很高，在嫩椰子水、椰青椰子水、成熟椰子水、椰子水飲料中，谷氨酸占總氨基酸含量 的 比 例 最 大，分 別 為50．09%，28．79%，21．92%，41．61%；其次為丙氨酸，所占比例分別為12．01%，21．72%，17．04%，14．0%；再次是天冬氨酸，所占比例分別是7．41%，9．73%，10．69%，7．90%；這3 種 氨 基 酸 組 分 總 量 占 總 氨 基酸含量的比例分別為69．51%，60．24%，49．65%，63．51%。由此可見，谷氨酸、丙氨酸和天冬氨酸是椰子水和椰子水飲料中最主要的氨基酸組分。

此外，不同成熟度椰子水和椰子水飲料中必需氨基酸也比較齊全，但含量不同，必需氨基酸含量依次為嫩椰子水、成熟椰子水、椰青椰子水、椰子水飲料。其中椰青椰子水、嫩椰子水、成熟椰子水和椰子水飲料中，必需氨基酸占總氨基酸含量的比例分別為15%，18．3%，22．5%，17．3%。其他的氨基酸含量參差不齊，椰青椰子水中氨基酸種類齊全，絲氨酸、精氨酸和纈氨酸的含量較高；嫩椰子水中絲氨酸、精氨酸和蘇氨酸含量較高；成熟椰子水中絲氨酸、精氨酸、賴氨酸和蘇氨酸的含量豐富；椰子水飲料中絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸和蛋氨酸的含量豐富。說明椰子水及其飲料中精氨酸、絲氨酸和蘇氨酸及賴氨酸的含量也較豐富。由此對(duì)比可以看出，嫩椰子水中氨基酸含量最豐富，總氨基酸含量最高，必需氨基酸含量也較高，還含有小兒發(fā)育期間必需的組氨酸和早產(chǎn)兒所必需的精氨酸、胱氨酸和酪氨酸，很新鮮，非常適合作為天然椰子水飲料的原料。椰青椰子水通常作為天然營養(yǎng)、健康安全的飲料直接飲用。而成熟椰子由于在生長后期各種營養(yǎng)成分大部分已經(jīng)消耗，不夠新鮮，而且在貯藏期間很容易發(fā)生變質(zhì)，所以成熟椰子水的總氨基酸含量較低，不適宜作為制備飲料的原料。本試驗(yàn)加工的椰子水飲料中含有豐富的氨基酸，特別是必需氨基酸，由于加工過程中采用了高溫殺菌，飲料中氨基酸的含量有所降低，但基本保留了嫩椰子水中的營養(yǎng)成分，具有獨(dú)特的營養(yǎng)保健價(jià)值，可以為人體提供較為豐富的氨基酸組分，在飲料產(chǎn)業(yè)有著廣闊的開發(fā)利用價(jià)值和市場(chǎng)潛力。

表2 椰子水及其飲料中的氨基酸含量的比較Table2 Comparative studies on amino acids content of coconut water and beverage／（10－2 mg·g－1 ）

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用氨基酸自動(dòng)分析儀分別對(duì)不同成熟度椰子和椰子水飲料進(jìn)行了氨基酸組分測(cè)定，并進(jìn)行對(duì)比分析，判斷它們營養(yǎng)成分的差別、營養(yǎng)價(jià)值的高低及品質(zhì)的高低。結(jié)果表明，嫩椰子水中氨基酸含量最豐富，非常適合作為天然椰子水飲料的原料，由此作為椰子原料選擇的依據(jù)。本研究彌補(bǔ)了對(duì)不同成熟度椰子水和椰子水飲料中氨基酸組分和含量研究的空白，可以為椰子水飲料的研發(fā)提供一定的理論依據(jù)。為了確保椰子水飲料中含有豐富的氨基酸成分和較高的含量，需要選擇成熟度適宜、新鮮的嫩椰子，通過試驗(yàn)確定最優(yōu)配方，在保證椰子水飲料品質(zhì)和保質(zhì)期的條件下適當(dāng)降低殺菌的溫度和時(shí)間，有望開發(fā)出一種天然營養(yǎng)和適合大眾口味的椰子水飲料，提高椰子水的利用價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。

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